葡萄糖激酶基因启动子－30位点PCR扩增的实验条件研究 论文发表

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主要仪器：PE9600基因扩增仪；BIO-RAD Power Pac 3000型电泳仪；Mini-PROTEIN Ⅱ型电泳槽及Gel Doc 1000紫外图像分析系统；TJ－6型低温离心机；430 pH计；p10, p100微量加样器。

主要试剂：5O D 260的寡核苷酸引物；100m m ol/L的dNTP；低熔点琼脂糖；5U/μl的Taq酶。

1.2 方法

模板的准备：本文使用的模板是从人体白细胞中应用酚/氯仿/异戊醇提取的基因组DNA [1]。提取的模板用100μl TE缓冲液，60℃加热10－15分钟溶解后，-20℃冰冻保存。

目的片段的扩增：寡核苷酸引物根据文献报道设计：上游引物为5’-CAAGGCGATTGAGTGGTCACCATG-3’，下游引物为5’-GACTGTGTCTCTCACATCCTAGCC-3’，扩增片段长度为258个碱基。反应体系中模板1μl，10×缓冲液3μl，加双蒸水至30μl条件不变，分别变化Taq酶、dNTP、引物、Mg 2+的浓度，按94℃预变性5min，后94℃1min，60℃1min，72℃1min进行35个循环，最后72℃延伸5min。用2％琼脂糖凝胶电泳，透射式紫外灯下观察扩增产物片段。

2 结果

2.1 PCR实验条件 论文发表

2.1.1通常PCR实验的酶用量范围为0.5U-2U。其他扩增条件不变的情况下设定系列Taq酶量0.5～5U之间。

结果表明，均可以扩增出目的DNA，产物量之间并无差异，但5U时出现非特异性扩增。为了使以后扩增更加有效，选择Taq酶量为1U。

2.1.2通常引物的浓度常用的范围为0.1-1μmol/L。高浓度的引物可能会引起反应的错配或非特异性产物。其他扩增条件不变的情况下设定系列引物浓度，范围设计在0.1～1μmol/L的浓度之间。结果表明，均有产物扩出，引物二聚体的浓度依次增加，但引物浓度超过0.3μmol/L时产物量接近最高而二聚体的浓度相对低；当到达1μmol/L时二聚体明显过剩，产物量反而降低；选择引物二聚体较少而产物量高时的引物浓度0.3μmol/L为最佳浓度。

2.1.3一般反应中每种dNTP的最终浓度可为20-200μm

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一、概况 由于我国人民生活水平低和卫生资源溃乏，造成乙肝泛滥。据统计：我国有乙肝病毒携带者约1.5亿、慢性迁延性肝炎约2500万、慢性活动性肝炎约1000万、重症肝炎约150万、肝硬化约100万和肝癌16～30万。肝硬化和肝癌80%以上是由乙肝病毒引起，而且80%左

【摘要】基因工程在诊