摘要：红豆杉属于浅根植物，其主根不明显、侧根发达，是世界上公认濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，是经过了第四纪冰川遗留下来的古老孑遗树种，在地球上已有250万年的历史。由于在自然条件下红豆杉生长速度缓慢，再生能力差，所以很长时间以来，世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。1994年红豆杉被我国定为一级珍稀濒危保护植物，同时被全世界42个有红豆杉的国家称为“国宝”，联合国也明令禁止采伐，是名符其实的“植物大熊猫”。
关键词：红豆杉,种植技术,农业科技论文发表
红豆杉为常绿乔木，小枝互生，到秋天变黄绿色或淡红褐色;冬芽鳞片背部圆或有钝棱脊;镰刀形叶子，二列式，长1.5-3厘米，比其他红豆杉属的更阔，末端尖而细小，叶底有两道黄间;花腋生，雌雄异株，雌花只有一个胚珠，下托鳞片数枚;扁卵形种子，两侧各有一不明显的棱脊，围有红色杯状假种皮。
菌株YEP731、YEP822和YEP751 的ITS扩增序列分别为564、599、532 bp，该序列在EMBL数据库中经BLAST比对，显示与链格孢属真菌(Alternaria sp.)有极高的同源性(99%)，系统进化树(图4) 结果亦表明这3株菌株与链格孢属真菌的亲缘关系最近;菌株YEP821与葡萄孢盘菌属真菌(Botryotinia sp.)的ITS序列有99%的一致性;菌株YEP742与葡萄刺盘孢属真菌(Colletotrichum sp.)的ITS序列有99%的一致性;菌株YEP442与拟茎点霉属(Phomopsis sp.)的ITS序列有99%的一致性;菌株YEP611与枝孢菌属真菌(Cladosporium sp.)的ITS序列有99%的一致性。上述相关序列均在ENA(European Nucleotide Archive)完成注册，相应EMBL登录号为HG530662-HG530668。
本试验从南方红豆杉的根部树皮中分离得到69株内生真菌，形态学鉴定其分属16属， 通过HPLC法检测发酵物中紫杉醇的含量， 发现有7株菌株能够产生紫杉醇， 再经过ITS序列分析确定分别属于链格孢属(Alternaria)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、刺盘孢属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)和枝孢菌属(Cladosporium)。 其中链格孢属真菌(Alternaria)平均产量为271.54 μg/L(其中一株产量更是高达303.06 μg/L)，是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌[8-11]，亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一[5]。随着后续研究的跟进，其紫杉醇产量有望跃上一个新台阶。
紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是一种具有广谱抗癌活性的三环二萜类化合物，1971年从太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifolia)中分离获得[1]，Schiff等[2]随后证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。采用微生物发酵法，即从红豆杉植物中寻找紫杉醇产生菌并加以菌种改良，结合微生物发酵技术以提高产量，是目前公认的环境友好、成本低廉的解决紫杉醇生产原料来源危机的好方法[3]。
自1993年Stierle等[4]从太平洋短叶红豆杉树皮中分离出可产紫杉醇内生真菌以来，国内外学者相继开展了筛选产紫杉醇内生真菌的研究，到目前为止，人们已发现了20多个属的内生真菌可以产生紫杉醇[5]，分离部位大部分取自树干和树枝。本研究从南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)根部采集树皮，从中分离筛选内生真菌，测定其产紫杉醇性能，以及通过形态特征和ITS序列分析对其进行了分类。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)根部树皮，来源于湖南省永州市阳明山国家森林公园内的野生红豆杉，样品采集后迅速装入无菌塑料袋中，4 ℃保存。
1)培养基。固体培养基为PDA培养基，琼脂 2.0%，灭菌后冷却至40～50 ℃ 加入 25 mg/L链霉素，半固体培养基琼脂浓度减半。液体种子培养基：PDA培养基不加琼脂。发酵培养基(g/L)[6]：葡萄糖 1.0，果糖3.0，蔗糖6.0，醋酸钠1.0，酵母粉0.5，MgSO4 0.36，KH2PO4 0.5，乙酸钠2.0，ZnSO4 2.5×10-3，MnSO4 0.5×10-3，Cu(NO3)2 0.65，KCl 0.06，Ca(NO3)2 2×10-3， FeCl2 2×10-3，苯丙氨酸 5×10-3，苯甲酸钠 0.5，KH2PO4 0.136。
2)试剂。紫杉醇标准品(纯度>95%，Sigma)， HPLC 流动相甲醇为色谱纯， 水为三蒸水，Ezup柱式真菌基因组抽提试剂盒(SK8259) ，PCR Buffer(10×)，dNTP(10 mol/L)，Taq酶(5U/μL)，引物：ITS1和ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海铂尚生物合成);其他试剂均为国产分析纯。
3)仪器。日本岛津LC-10ATvP高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、BIO-RAD PCR仪、恒温摇床。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株的分离与纯化 将南方红豆杉树皮置于无菌条件下，剥除根部外皮，留取内皮和韧皮部，切割成边长为0.5 cm×0.5 cm的正方形小块，用75%的乙醇表面消毒2～3 min，无菌水漂洗2～3次;滤纸吸干水分，斜插入半固体培养基中，每皿6～8块树皮，共50皿。28 ℃培养3～7 d，挑取自真皮向培养基基质生长的菌丝体微丝于固体培养基中，纯化2～3次，编号，保藏备用。
1.2.2 菌株的鉴定
1)形态学鉴定。将分离到的菌株于固体培养基，28℃恒温培养，每隔12 h记录菌落形态变化;显微形态观察采用插片法，40倍物镜;综合以上结果，依据菌落形态、菌丝体、孢子梗、营养细胞以及基质变化等特征，参考《真菌鉴定手册》进行鉴定[7]。
2)分子生物学鉴定。按上海生工SK8259真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板扩增ITS序列(扩增条件：预变性94 ℃、5.0 mim; 94 ℃、30 S，55 ℃、35 S， 72 ℃、1.0 min， 35个 循环;72 ℃延伸 8.0 min)
测序由上海铂尚生物技术有限公司完成，所得序列经EMBL数据库中的BLAST比对分析，并利用DNAMAN和MEGA软件进行系统进化树分析。
1.2.3 发酵培养 28 ℃接种待培养菌株至固体培养基，培养4～5 d，无菌生理盐水洗下孢子，接种至20 mL装液量的液体种子培养基中，3皿/瓶，28 ℃、220 r/min培养14～16 h后，将液体种子以8%的接种量接种至发酵培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养7 d。
1.2.4 紫杉醇的提取 发酵液4 800 r/min离心 20 min，收集上清液;所得菌体沉淀以 20 000 r/min 匀浆 15～20 min，使目标产物充分释放，再离心;将两次上清液合并，双层滤纸过滤，滤液 50 ℃旋转蒸发浓缩至原体积的 1/10，加入等体积氯仿充分振荡进行萃取，共萃取两次，合并有机相，无水Na2SO4 干燥，35 ℃旋转蒸发至干，样品加少量甲醇溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤， 定容至10 mL 备用。
1.2.5 样品中紫杉醇含量的检测
1)标准溶液配制。精确称取紫杉醇标准品1.0 mg， 用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液备用。将母液稀释成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L系列浓度的标准溶液。
2)色谱条件。日本岛津LC-10ATvP高效液相色谱仪，Kromstar C18 柱(250 mm×4.6 mm);流动相， 甲醇∶水(V/V) =65∶35;流速1.0 mL/min， 检测波长227 nm， 柱温28 ℃， 进样量10 μL。
2 结果与分析
2.1 内生真菌的分离及形态学鉴定
从南方红豆杉树皮中分离出69株内生真菌， 依据形态学鉴定，确定其分属16属。每个属中挑选生长性状优良的菌株，进行液体发酵培养，测定其发酵物的紫杉醇含量，相同种属菌株取紫杉醇产量平均值，未检出者则视为无效菌株，不在表内列出。共获得7株产紫杉醇菌株，对应的鉴定结果及紫杉醇产量见表1。
2.2 紫杉醇含量的检测
2.2.1 标准曲线的制作 取所配的紫杉醇标准品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，回归方程为■=16 518x-9475.1，r2= 0.998 1。结果表明，回归方程在0～40 mg/L范围内线性关系良好(图1)。
2.2.2 发酵液中紫杉醇的检测 紫杉醇标准品和链格孢属菌株(YEP751)发酵提取物的HPLC检测结果见图2和图3。在相同色谱条件下，紫杉醇标准品的保留时间为23.574 min，菌株发酵浓缩液在此时间处有一明显对应峰，即检测到菌株代谢产物中含有紫杉醇。
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