论文摘要：软骨退变是OA的主要病理特征，是多因素综合作用引起的软骨细胞、软骨基质及软骨下骨降解与合成偶联失衡的结果。胶原和蛋白多糖是软骨细胞外基质的主要成分，Ⅱ型胶原是软骨基质的特征性胶原成分，构成软骨内的纤维网架结构;蛋白多糖能吸引大量的水分子形成凝胶，保持软骨的膨胀能力和良好弹性。本文选自：《中国伤残医学》的原名是《伤残医学杂志》，《伤残医学杂志》创刊于1993年，原卫生部陈敏章部长、顾英奇副部长为创刊题词，在有关领导、各位编委、专家、作者、读者及广大医务工作者大力支持和帮助下，学术水平和编校质量不断提高，2006年经国家新闻出版署批准，更名为《中国伤残医学》，由卫生部主管，本刊由省级升格为国家级期刊。
引言
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以软骨退变、骨质增生及软骨下骨重建异常为特征的慢性骨关节病，易反复发作，缠绵难愈。随着年龄增加发病率逐渐增加，严重影响患者的生活质量，已成为严重的公共健康问题[1-2]。目前，OA治疗方法虽多，但主要以对症治疗为主，尚缺乏特效疗法。为此，寻找一种经济、方便、无创的有效疗法，成为医学界的共识。
中药复方治疗OA具有疗效可靠、价格低廉、副作用小的独特优势。补肾壮筋汤是《伤科补要》中治疗肝肾亏虚型OA的经典方，具有补益肝肾、强壮筋骨作用[3]，疗效显著。本研究以OA大鼠动物模型为研究对象，探讨补肾壮筋汤抑制OA软骨退变的作用机制。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级SD大鼠40只，8周龄，雄性，体质量220～250 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供合格证号：SCXK(沪)2007-0005。福建中医药大学实验动物中心提供清洁级实验动物环境设施(合格证号：医动学第23-016号)。实验动物的处置按照2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》规定。
1.2 药品、试剂与仪器 补肾壮筋汤(药物组成：熟地黄12 g、当归12 g、牛膝10 g、山萸肉12 g、茯苓12 g、续断12 g、杜仲10 g、白芍10 g、青皮5 g、五加皮10 g)由福建中医药大学国医堂提供;盐酸氨基葡萄糖胶囊，批号HC20090009，香港澳美制药厂生产。质量分数10%水合氯醛，批号SF0341，上海士锋生物科技有限公司生产;木瓜蛋白酶，批号107147，sigma公司生产;苏木精-伊红(HE)，批号 G1120，北京索莱宝科技有限公司生产;番红O-固绿，批号DB0082，北京雷根生物技术有限公司生产;基质金属蛋白酶-3(MMP-3)，批号fk1653Y，白细胞介素-1β(IL-1β)，批号fk1588Y，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，批号fk1721Y，透明质酸(HA)，批号fk2052Y，上海沪宇生物科技有限公司生产。ELX808U型酶标仪，美国宝特公司生产;TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂生产。
2 方 法
2.1 补肾壮筋汤水提物制备 取干燥、粉碎的补肾壮筋汤方药粉末105 g，加入1 050 mL的蒸馏水，提取2次，每次2.5 h，趁热过滤，浓缩，50 ℃真空干燥至恒重。
2.2 实验方法 SD大鼠40只，按随机数字表法分为正常组(10只)和造模组(30只)。造模组第1，4，7天，采用质量分数10%水合氯醛3 mL·kg-1
腹腔麻醉，采用质量分数4%木瓜蛋白酶0.2 mL双膝关节腔注射建立OA模型[4]。造模2周后按随机数字表法分为模型对照组、补肾壮筋汤组、阳性对照组，每组10只。各组给药剂量按照人和动物药物等效剂量换算[5]，已知A种动物每千克体质量用药量，求出B种动物每千克体质量用药剂量的换算公式，B种动物的剂量(mg)= A种动物的剂量(mg·kg-1)×
W(折算系数6.25)×B种动物的体质量(kg)。正常组常规喂养，模型对照组以等量生理盐水灌胃，补肾壮筋汤组以补肾壮筋汤10.5 g·kg-1·d-1
灌胃，阳性对照组予以盐酸氨基葡萄糖胶囊溶液
150 mg·kg-1·d-1灌胃，每日1次，持续给药12周。干预12周后，取双膝关节股骨髁，质量分数4%多聚甲醛固定，常规脱钙、包埋和切片，分别采用HE、番红O-固绿染色，观察软骨组织形态的变化。参考Mankin's OA组织学分级方法进行评分[6]。软骨退变程度计分依据表层软骨细胞分裂增生(0～3分)、细胞排列(0～3分)、潮线(0～3分)、血管翳样物生成(0～3分)、AB-PAS染色(0～4分)，最高为16分。
2.3 检测方法
2.3.1 HE染色 切片常规脱蜡，苏木精染液染色4 min，质量分数1%盐酸酒精分化液分色10 s，伊红染液染色3 min，脱水透明封片，观察软骨形态结构的变化。
2.3.2 番红O-固绿染色 切片常规脱蜡，新鲜配制的试剂，Weigert苏木素染液染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，蒸馏水洗1 min;固绿染色液内浸染5 min，蒸馏水洗1 min;番红O染色液内浸染
2 min，蒸馏水洗1 min;用乙酸溶液洗涤切片1 min，脱水透明封片，观察软骨基质蛋白多糖含量的变化。
2.3.3 ELISA法检测关节液的生化指标 采用质量分数10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔麻醉，抽取双膝关节液。抽取前先注射2 mL生理盐水，反复活动膝关节后，抽取0.8 mL关节液，-80 ℃保存。关节液中MMP-3、IL-1β 、TNF-α、HA含量采用ELISA法检测。检测过程严格按照试剂说明书的操作步骤，标准曲线的相关系数为0.995。
2.4 统计学方法 采用SPSS l3.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组数据之间比较采用单因素方差分析，两组数据之间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 补肾壮筋汤抑制OA的软骨退变 正常组软骨表面光滑平整，四层结构清晰，软骨细胞排列整齐，潮线清晰完整，软骨下骨的骨小梁密度和宽度适中，排列规律，骨细胞呈梭形，分布均匀，见图1(1)、图1(2)。模型对照组软骨表面粗糙，四层结构不清晰，软骨细胞排列紊乱，潮线模糊、多重或中断，软骨下骨囊变、骨小梁稀疏，见图1(3)、图1(4)。补肾壮筋汤组、阳性对照组软骨、软骨下骨的改变，介于正常组与模型对照组之间，见图1(5)、图1(6)、图1(7)、图1(8)。
3.2 补肾壮筋汤抑制软骨基质的蛋白多糖含量减少和纤维变性 正常组软骨基质中蛋白多糖呈现红染，胶原纤维呈绿色，软骨下骨的骨小梁呈绿色，见图2(1)、图2(2)。模型对照组软骨基质中蛋白多糖呈淡红色，染色范围减少，而绿色范围增大，提示软骨基质中蛋白多糖含量减少，纤维成分增多，见图2(3)、图2(4)。补肾壮筋汤组、阳性对照组软骨基质中蛋白多糖与胶原纤维的变化，明显好于模型对照组，见图2(5)、图2(6)、图2(7)、图2(8)。
3.3 补肾壮筋汤降低OA软骨退变的程度 软骨Mankin's评分，模型对照组(11.17±2.32)分、补肾壮筋汤组(8.50±2.07)分与阳性对照组(8.33±
1.63)分，明显高于正常组的(1.83±0.75)分，补肾壮筋汤组
阳性对照组明显低于模型组(P < 0.05)，补肾壮筋汤组与阳性对照组差异无统计学意义
(P > 0.05)，见图3。
注 与正常组比较，1)P < 0.01;与模型对照组比较，
2)P < 0.05
3.4 补肾壮筋汤降低炎性细胞因子的含量与增强HA的含量 关节液中IL-1β、TNF-α、MMP-3含量，模型对照组、补肾壮筋汤组与阳性对照组明显高于正常组(P < 0.01)，补肾壮筋汤组与阳性对照组明显低于模型组(P 0.05)，补肾壮筋汤组与阳性对照组差异无统计学意义(P > 0.05)，见图4(1)、图4(2)、图(3)。关节液中HA含量，模型对照组、补肾壮筋汤组与阳性对照组明显低于正常组
(P < 0.01)，补肾壮筋汤组与阳性对照组明显高于模型对照组(P < 0.05)，补肾壮筋汤组与阳性对照组差异无统计学意义(P > 0.05)，见图4(4)。
(1) 各组关节液中IL-1β含量
(2) 各组关节液中TNF-α含量
(3) 各组关节液中MMP-3含量
图4 各组关节液中IL-1β、TNF-α、MMP-3及HA含量
注 与正常组比较，1)P < 0.01;与模型对照组比较，2)P < 0.05
4 讨 论
OA疼痛病机分为虚实两类，肝肾亏虚、气血虚弱，则筋骨失养，即不荣则痛，属虚证;风寒湿邪侵袭，则经络气血瘀阻，即不通则痛，属实证。软骨下骨属中医学“骨”范畴，关节软骨、韧带、滑膜、关节囊属中医学“筋”范畴。软骨下骨囊变、软骨退变属于痿证，以肝肾亏虚为病理特点;骨赘形成、滑膜炎症属于痹证，以脉络瘀滞为病理特点。OA核心病机为本痿标痹，病在筋骨，病位在肝肾，肝肾亏虚，筋骨失养而为痿，腠理空虚易感风寒湿之邪而为痹[7]。基于OA本痿标痹的病理特点，治以补肾柔肝为主(治痿)，辅以祛风除湿散寒(治痹)。补肾壮筋汤以熟地黄、山萸肉补益肝肾，填精补髓，为君药;续断、杜仲、五加皮助君药补益肝肾，强筋壮骨，祛风除湿，为臣药;当归补血活
血，白芍敛阴和营、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除湿，青皮行气疏肝，共为佐药;牛膝补益肝肾，强筋壮骨，活血通经，引火(血)下行，使方中诸药直达病所，为使药。诸药合用，共奏补肾柔肝、祛风除湿散寒之功效，长期用于肝肾亏虚型OA的治疗，疗效显著[3]。
软骨退变是OA的主要病理特征，是多因素综合作用引起的软骨细胞、软骨基质及软骨下骨降解与合成偶联失衡的结果。胶原和蛋白多糖是软骨细胞外基质的主要成分，Ⅱ型胶原是软骨基质的特征性胶原成分，构成软骨内的纤维网架结构;蛋白多糖能吸引大量的水分子形成凝胶，保持软骨的膨胀能力和良好弹性。OA时，软骨基质结构发生破坏，以Ⅱ型胶原和蛋白多糖的破坏为主，出现胶原的变性与裂解，蛋白多糖含量下降，引起软骨细胞功能改变，导致基质成分的合成减少，从而加速软骨退变[8-9]。本研究HE、番红O-固绿染色结果显示，补肾壮筋汤通过抑制软骨基质中蛋白多糖含量的减少和胶原纤维的变性，延缓OA的软骨退变。
炎症反应介导的软骨基质降解是引起OA软骨退变的关键因素，也在OA的病理过程中发挥重要的调控作用。细胞因子是一组多肽类细胞调节物质的总称，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子、干扰素、细胞刺激因子等。正常情况下，体内的细胞因子之间存在相互抑制、相互协同的一个复杂调控网络，维持体内免疫应答的规律进行，保持体内微环境的稳态。在各种刺激因素下，关节内微环境稳态的变化，引起软骨细胞功能的改变，导致细胞因子表达的失控，产生炎症反应，从而促进OA的软骨退变[10-11]。
IL-1β、TNF-α诱导炎症反应，促进软骨退变，在OA发病过程中发挥重要的调控作用。IL-1β是软骨退变和炎症反应的重要介质，增强MMP-3表达，抑制软骨基质成分的合成，促进软骨细胞终末分化，引起软骨基质稳态失衡[12]。TNF-α不仅参与滑膜炎症反应，还能抑制蛋白聚糖的合成，促进软骨基质降解[13]。IL-1β、TNF-α又称为“前炎症因子”，TNF-α既可引起前炎症反应，又能有效调节IL-1β的表达，且可启动OA细胞因子的级联反应，刺激滑膜细胞与软骨细胞产生MMP-3，加速软骨基质降解[14-15]。HA带有负电荷，填充在软骨细胞与胶原纤维之间，具有保护软骨细胞，稳定胶原网状结构，从而维持软骨的力学特性。在OA病理过程中，HA含量明显减少，促进了OA的软骨退变[16]。本研究结果表明，补肾壮筋汤能有效降低关节液中IL-1β、TNF-α、MMP-3的含量，增强关节液中HA的含量，从而抑制炎症反应，延缓OA的软骨退变。
综上所述，补肾壮筋汤通过降低炎性细胞因子表达，增强HA含量，抑制软骨基质中蛋白多糖含量的减少和胶原纤维的变性，从而延缓OA的软骨退变。本研究初步揭示补肾壮筋汤抑制OA软骨退变的可能作用机制之一，其具体的分子调控机制，有待于更深入的实验研究。
5 参考文献
[1] Kroman SL，Roos EM，Bennell KL，et al.Measurement properties of performance-based outcome measures to assess physical function in young and middle-aged people known to be at high risk of hip and/or knee osteoarthritis：a systematic review[J].Osteoarthritis Cartilage，2014，22(1)：26-39.
[2] Corbett MS，Rice SJ，Madurasinghe V，et al.Acupuncture and other physical treatments for the relief of pain due to osteoarthritis of the knee： network meta-analysis[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21(9)：1290-1298.
[3] 李西海，刘献祥.补肾壮筋汤干预肝肾亏虚型膝骨性关节炎软骨退变的机制探讨[J].福建中医药，2011，42(5)：58-60.
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