摘要 为开发枸杞汁杀菌新技术，采用超高压和热杀菌处理枸杞汁，分析微生物、活性成分、抗氧化活性及色泽等品质指标在处理前、后及贮藏期间的变化。 两种处理后枸杞汁微生物均小于 10 CFU/mL，而超高压组菌落总数在贮藏结束时为 117 CFU/mL，超过行业标准要求;pH 值、可滴定酸和可溶性固形物含量在两种处理前、后及贮藏期间均无显著变化;处理前、后及贮藏期间枸杞多糖含量基本稳定，而两处理组的总类胡萝卜素和总酚含量在贮藏期间呈下降趋势，超高压能更好保留其含量;在处理前、后及贮藏期间，超高压对枸杞汁抗氧化活性的保持也优于热处理，通过相关性分析发现抗氧化活性与总酚和总类胡萝卜素含量呈显著正相关;通过处理前、后各颜色指标的对比，发现超高压能更好地保持枸杞汁原有的颜色，贮藏期间超高压组 L* ，a* ，b* 值降低量高于热处理组，通过 PPO 及 POD 活性分析推测酶促色变是引起贮藏期间超高压组颜色变化大于热处理组的重要原因之一。 本研究为超高压应用于枸杞汁加工提供理论依据。
关键词 超高压; 枸杞汁; 品质; 贮藏
枸杞是茄科枸杞属的多年生双子叶落叶灌木，是我国重要的经济作物之一，其中以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)最富盛名。 宁夏枸杞不仅富含维生素、蛋白质以及微量矿质元素等营养物质，还含有多种活性成分， 如类胡萝卜素、 多酚类物质、枸杞多糖等，这些物质赋予枸杞抗氧化、防衰老、抗肿瘤等多种药理功能，因此枸杞是典型的药食两用植物[1-2]。
截至 2013 年， 宁夏枸杞种植面积已发展到 5.67 万 hm2 ，产量达到 13 万 t [3]。 尽管宁夏枸杞资源丰富，但目前仍以干制枸杞子为主。 这种产品的附加值较低， 而且在制干过程中容易发生二次污染而损害产品质量[4]。 枸杞汁可有效保留枸杞原有的营养成分，保健作用显著，是枸杞深加工的一条特色之路，有着巨大的市场潜力[5-6]。 目前，枸杞汁的杀菌多采取传统的热杀菌方式， 但较高的温度在破环微生物和酶的同时也对食品品质带来不利影响， 如枸杞汁褐变度的提高及总酚含量的下降 [7]。 开发枸杞汁杀菌新技术以提高其产品品质，是枸杞汁加工需要解决的重要问题。
超高压 (High hydrostatic pressure， HHP)技术是一项重要的食品非热加工技术， 可在较低温度(<60 ℃)下杀灭食品中致病菌和腐败菌的营养体，保证食品安全并延长产品货架期，同时与传统热杀菌相比能较好地保持食品品质[8-9]。 目前，超高压已应用于多种果汁的加工中，如草莓汁[9]、石榴汁[10]、苹果汁[11]等，而超高压用于枸杞汁加工的研究仍未见报道。 本研究主要比较超高压和热杀菌对鲜榨枸杞汁品质的影响， 为超高压技术应用于枸杞汁的加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验原料 枸杞鲜果，产地宁夏中卫，品种为宁杞 5 号，放入 4 ℃冷库中保藏待用。
1.1.2 主要试剂 平板计数培养基、 孟加拉红培养基， 均由北京奥博星生物技术有限责任公司生产;氢氧化钠、无水碳酸钠、没食子酸、蒽酮、愈创木酚、邻苯二酚等均属分析纯药品，购于北京化学试剂公司;1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、维生素 E 衍生物(Trolox)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂等均属分析纯药品，购于北京拜尔迪生物技术有限公司;2，4，6-三 (2-吡啶)-1，3，5-三吖嗪 (TPTZ)， 购于 Sigma-Aldrich 上海贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
超高压设备 HHP-700，包头科发新型高技术食品机械有限责任公司;FT74XUHT 灭菌机，英国 Armfield 公司;JYL-610 打浆机， 山东九阳股份有限公司;PB-10 标准型 pH 计，德国 Sartorius 公司; WAY-2S 数字阿贝折射仪， 上海精密科学仪器有限公司;UV-762 紫外分光光度计， 上海精密科学仪 器 有 限 公 司;HunterLab Color Quest XE 全 能色差仪，美国 Hunterlab 公司;RE-52AA 旋转蒸发器，上海阵捷实验设备有限公司;CR21GIII 型离心机，日本 Hitachi 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 枸杞汁的制备 选择大小均一品相优良的枸杞鲜果，清洗干净后以 1∶2 的料液比加水打浆，脱气后得到鲜榨枸杞汁。 一部分枸杞汁立即灌装到 100 mL 的 PET 瓶中并手工拧紧，暂存于 4 ℃冷库(存放时间不超过 3 h)，用于超高压处理;一部分放于食品容器中，暂存于 4 ℃冷库(存放时间不超过 3 h)，用于热处理。
1.3.2 超高压处理 将灌装好的鲜榨枸杞汁置于超高压设备中，于室温下进行超高压处理。 经过前期预试验， 发现在 500 MPa 压力下处理 5 min 即可使杀菌效果达到 NY/T 434-2007《绿色食品、果蔬汁饮料》 行业标准的要求， 其中菌落总数小于 100 CFU/mL， 霉菌酵母未检出， 因 此 选 用 500 MPa/5 min 为超高压处理条件进行品质评价。 部分处理后的样品放于 4 ℃下贮藏， 用于测定贮藏期内品质的变化。
1.3.3 热处理(heat treatment，HT) 采用 UHT 灭菌机对鲜榨枸杞汁进行热处理，杀菌条件为 85 ℃/ 15 s， 此杀菌条件同样可使杀菌效果达到 NY/T 434-2007《绿色食品、果蔬汁饮料》行业标准的要求。 经过热处理的枸杞汁在无菌超净工作台中灌装到 100 mL 的 PET 瓶中，用于品质评价。 部分热处理的枸杞汁放于 4 ℃下贮藏， 用于测定贮藏期内品质的变化。
1.3.4 微生物的测定 枸杞汁中的菌落总数及霉菌、酵母数均采用国标的平板计数法。 将待测枸杞汁用 0.85%的生理盐水以 10 倍递增梯度稀释法稀释到适宜稀释度，在每个平板中加入 1 mL 的稀释液和约 20 mL 的相应培养基， 放入合适温度的培养箱进行培养。 其中菌落总数测定选用平板计数培养基，在(36±1) ℃下培养 48 h±2 h 后进行计数。 霉菌和酵母数测定选用孟加拉红培养基，于(28 ± 1) ℃下培养 5 d 后计数。
1.3.5 pH 值 的 测 定 采 用 pH 计 测 定 枸 杞 汁 的 pH 值， 采用 pH 值为 4.01，6.86 和 9.18 的标准缓冲液进行校正。
1.3.6 可 滴 定 酸 (TA) 的 测 定 参 照 Lisiewska 等[12]的方法。 取 10 mL 枸杞汁放入小烧杯中，置于磁力搅拌器上， 调节适当的搅拌速度， 滴加 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液至 pH 8.1。
1.3.11 总酚含量的测定 参照 Singleton 等 [14]的方法， 采用 Folin-ciocalteu’s 法测定总酚含量，并略作修改。 样品测定：枸杞汁于 4 ℃、11 000 r/min 下离心 10 min，取上清液备用。 取 0.4 mL 枸杞汁上清液(以蒸馏水为空白对照)与 2 mL 稀释 10 倍的 Folin-phenol 试剂混合后，于室温下避光反应 1 h，再加入 1.8 mL 7.5%的 Na2CO3 溶液，室温下避光反应 15 min，用分光光度计测定 765 nm 处的吸光值， 总酚含量以每 100 mL 样品中含有相当于 mg 没食子酸表示。 没食子酸标准曲线的制作：配置 质 量 浓 度 分 别 为 10，20，40，60，80 μg/mL 的 没食子酸标准溶液，将 0.4 mL 不同浓度的没食子酸标准溶液分别于 2 mL 稀释 10 倍的 Folin-phenol 试剂混合后，于室温避光反应 1 h，再加入 1.8 mL 7.5%的 Na2CO3 溶液， 室温下避光反应 15 min，用分光光度计测定其在 765 nm 处的吸光值，制作标准曲线。 每次测定样品需要重新制作标准曲线。
1.3.12 抗氧化活性的测定
1.3.12.1 DPPH 自由基清除能力 参照 Odriozola-Serrano 等[15]的方法，并略作修改。 样品测定：取 25 μL 枸 杞 汁 加 入 到 4 mL ·DPPH 溶 液 (0.14 mmol/L)中，常 温 遮 光 反 应 1 h，测 定 样 品 在 517 nm 处的吸光值，以甲醇溶液为对照。 根据加入样品前后的吸光值变化计算样品对·DPPH 的清 除率 ， 并 且 根 据 Trolox 标 准 曲 线 换 算 为 mmol/L Trolox。 Trolox 标准曲线的制作：配置浓度分别为 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 的 Trolox 溶液， 分 别取 25 μL 与 4 mL ·DPPH 溶液在常温下避光反应 1 h，测定反应液在 517 nm 处的吸光值，制作标准曲线。 每次测定样品需要重新制作标准曲线。
1.3.12.2 铁离子还原能力 (FRAP) 参照 Benzie 等[16]的方法，并略作修改。 样品测定：取 100 μL 枸杞汁加入到 4 mL Fe3+-三吡啶-三吖嗪 (TPTZ)工作液中 (该工作液由 10 mmol/L 的 TPTZ 溶液、20 mmol/L 的 FeCl3 溶液和 pH 为 3.6 的 醋 酸 盐 缓 冲液按照体积比 1∶1∶10 配置而成)， 在 37 ℃条件下反应 10 min，测定其在 593 nm 处的吸光值，以蒸馏水为空白对照。 样品的铁还原能力以每 mL 样 品相当于 mmol Trolox 的铁还原能力表示。 Trolox 标准曲线的制作： 配置浓度分别为 0.05，0.1，0.2， 0.4，0.8 mmol/L 的 Trolox 溶液，分别取 100 μL 与 4 mL TPTZ 工作液在 37 ℃下反应 10 min，测定反应液在 593 nm 处的吸光值，制作标准曲线。 每次测定样品需要重新制作标准曲线。
1.3.13 酶 活 性 的 测 定 多 酚 氧 化 酶(PPO)和 过氧化物酶(POD)的提取：将 20 mL 含 4% PVPP 的磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.5)加到 20 mL 枸杞汁中， 混合均匀后在 4 ℃下静置 4 h，12 000 r/min、4 ℃离心 15 min，上清液为酶粗提液。
PPO 酶活性测定：采用分光光度法，反应底物为 0.07 mol/L 的邻苯二酚溶液 (用 0.1 mol/L，pH 6.5 的磷酸缓冲液配制)。 取 2 mL 底物，30 ℃保温 10 min 后，加入 1 mL 提取的 PPO 粗酶液，立即在 420 nm 处测定吸光值随时间的变化曲线，测定时间为 15 min，扫描时间间隔为 0.1 s，曲线直线部分的斜率即为酶活。
POD 酶活性测定：采用分光光度法，反应底物为 1%(体 积 分 数)的 愈 创 木 酚(用 0.2 mol/L，pH 6.5 的磷酸缓冲液稀释)及 1.5%的过氧化氢溶液。取 2 mL 1%的愈创木酚加入 0.2 mL 1.5%的过氧化 氢，30 ℃保 温 10 min 后， 加 入 0.8 mL 提 取 的 POD 粗酶液，立即在 470 nm 处测定吸光值随时间的变化曲线，测定时间为 15 min，扫描时间间隔为 0.1 s，曲线直线部分的斜率即为酶活。
1.3.14 数据统计分析 所有试验均重复 3 次。 不同处理方法间的数据使用 SPSS 22 软件进行显著性差异分析，显著性水平为 0.05，并用标记字母法进行标记;采用 SPSS 22 软件进行 Pearson 相关性分析。 使用 OriginPro 8.5 软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 超高压和热杀菌对枸杞汁微生物、pH 值、可滴定酸与可溶性固形物的影响
如 图 1 所 示， 未处理枸杞汁的菌落总数为 1.38×105 CFU/mL，经超高压和热处理后菌落总数分别为 5 CFU/mL 和 4 CFU/mL，符合《NY/T 434- 2007 绿色食品、果蔬汁饮料》行业标准对菌落总数≤100 CFU/mL 的要求。 经超高压和热处理后，枸杞汁中的霉菌和酵母均未检出。 说明超高压和热处理均能有效杀灭枸杞汁中微生物， 保证其安全。 在贮藏前期，超高压处理组的菌落总数与热处理组相比没有显著性差异(P>0.05);但随着贮藏时间的延长， 超高压处理组中的菌落总数出现明显上升趋势，在第 28 天达到了 117 CFU/mL，而热处理组的菌落总数仍基本保持稳定; 在整个贮藏期内两种处理生产的枸杞汁均没有霉菌和酵母的检出。 这一结果表明热处理相对超高压处理能更有效控制微生物在贮藏期内的生长。 通过测定超高压和热处理苹果汁的微生物，Zhao 等[11]发现在贮藏期内霉菌和酵母均未检出， 但 2 种处理组的菌落总数在贮藏期内呈上升趋势， 而且超高压处理组的菌落总数一直高于热处理组。 超高压枸杞汁的菌落总数在贮藏期内的提高， 一方面可能源于处理后残存微生物在贮藏期内的繁殖， 另一方面可能由于超高压引起的亚致死微生物在贮藏期内的复苏及繁殖。 目前已有许多研究者发现超高压处理能使微生物进入亚致死状态。Jordan 等[17]研究发现，超高压处理可使接种到苹果汁、番茄汁和橙汁中的大肠杆菌(Escherichia coli)和单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 进入亚致死状态; Munoz 等[18]也发现接种到橙汁、苹果汁和蔬菜汤中的 E. coli 在超高压处理下出现亚致死现象。 另外， 研究者还发现超高压处理产生的亚致死微生物能在贮藏期内复苏并繁殖[19-20]。
未处理枸杞汁的 pH 值、 可滴定酸和可溶性固形物含量分别为 4.81±0.006、(0.181±0.001)%和(7.81±0.010)°Brix。超高压和热处理后及贮藏期间这 3 项指标均无显著变化(P>0.05)。 该结论与前人研究结果一致，刘兴辰等[21]研究发现超高压和热处理对胡萝卜汁的 pH 值、 可滴定酸和可溶性固形物含量无显著影响;另外，Landl 等[22]和 Zhao 等[23]分别考察了超高压及热处理的苹果泥及黄瓜汁在贮藏期间的品质变化， 他们均发现超高压处理组和热处理组的 pH 值、 可滴定酸和可溶性固形物含量在贮藏期间无显著变化。
2.2 超高压和热杀菌对枸杞汁活性成分的影响
表 1 为超高压和热处理对枸杞汁中 3 种活性成分的影响。 枸杞多糖是枸杞中最为重要的活性成分， 未处理枸杞汁中的含量为 0.404 g/100 mL，超高压或热处理均未使枸杞汁中的枸杞多糖含量发生显著变化(P>0.05);同时，2 种处理加工的枸杞汁中的枸杞多糖含量在贮藏期间也未发生显著变化(P>0.05)。 除了本研究外，目前仍没有超高压处理对枸杞多糖含量影响的研究。 刘威等[24]研究了热处理对枸杞汁中枸杞多糖含量的影响， 发现不同处理温度下枸杞多糖含量随时间无明显变化规律， 但通过数据可以看出当处理时间为 15 s 时枸杞多糖的含量无明显变化，与本研究结果一致。由于组成枸杞多糖的糖类相对稳定， 因此本研究采用的超高压和热处理条件可能对其影响较小。
从表 1 可以看出， 热处理组的总类胡萝卜素含量与未处理组相比无显著差异(P>0.05)，而超高压枸杞汁中的总类胡萝卜素含量却显著提高了(P<0.05)。 这可能是由于超高压处理引起枸杞细胞的细胞壁破裂，从而促进了类胡萝卜素的溶出。蒋兵等[25]也发现超高压胡萝卜汁中的类胡萝卜素含量高于热处理组。 在整个贮藏期间，两种处理组中的总类胡萝卜素含量均表现出下降的趋势，在贮藏期结束时超高压处理组的总类胡萝卜素含量损失了 31.4%，而热处理组损失了 41.9%，表明超高压处理能更大限度地保留枸杞汁中总类胡萝卜素的含量。 蒋兵等[25]和迟淼[26]的研究也表明超高压和热处理的胡萝卜汁及橙汁中的类胡萝卜素含量在贮藏过程中呈下降趋势。 另外，与热处理相比， Zulueta 等[27]发现在贮藏期间超高压处理能更好地保留橙汁-牛奶饮料中的类胡萝卜素含量。
相关知识推荐：食品加工论文发表技巧
由表 1 可见， 未处理枸杞汁中的总酚含量为 40.52 mg/100 mL， 经超高压处理后其总酚含量未发生显著变化(P>0.05)，但热处理显著降低了枸杞汁的总酚含量(P<0.05)。刘兴辰等[21]也发现超高压处理对胡萝卜汁的总酚含量无显著影响， 而热处理组的总酚含量显著降低。 因为酚类物质是热不稳定性的， 所以高温可能会使部分酚类物质降解; 然而低于 1 000 MPa 的超高压处理不会破坏分子内部共价键， 因此对小分子物质如酚类的影响较小[28]。 与总类胡萝卜素含量的变化一致，在贮藏期间 2 种处理组的总酚含量均呈下降趋势，贮藏期结束时超高压处理组损失了 14.6%， 而热处理组的总酚含量损失了 23.5%， 表明超高压处理对枸杞汁中总酚含量的保留率优于热 处 理 。 Keenan 等[29]通过研究也发现在贮藏期间热处理果昔中总酚含量的下降程度要高于超高压处理组。
酚类物质和类胡萝卜素属于抗氧化成分，它们的含量在贮藏期间的下降可能与两方面原因有关。 一方面是由于枸杞汁中的溶解氧所致，这些氧气在贮藏期间通过形成氧自由基而使酚类物质和类胡萝卜素发生氧化，并最终使它们降解;另一方面是由胞内参与酚类物质及类胡萝卜素降解的酶类在榨汁过程中的释放所引起的， 如降解酚类物质的 PPO 酶，这些酶所引起的降解反应会使酚类物质和类胡萝卜素含量在贮藏期间逐渐下降。
由于总酚和总类胡萝卜素含量与食品的抗氧化活性有关， 因此本研究还对枸杞汁的抗氧化活性进行分析， 以探究总酚和总类胡萝卜素含量与抗氧化活性之间的关系。
2.3 超高压和热杀菌对枸杞汁抗氧化活性的影响
本研究选用了·DPPH 清除能力和铁还原能力两种方法来评价超高压和热处理前、 后及贮藏期间枸杞汁的抗氧化活性变化。 从图 2 可以看出，超高压处理对枸杞汁的·DPPH 清除能力和铁 还原能力均无显著影响(P>0.05);虽然热处理对枸杞汁的·DPPH 清除能力也无显著影响，但却降低了枸杞汁的铁还原能力， 表明超高压处理能更好地保持枸杞汁的抗氧化活性。 图 3 为超高压和热处理枸杞汁在贮藏期间的·DPPH 清除能力和 铁还原能力的变化。 如图 3 所示， 两种处理组的· DPPH 清除能力和铁还原能力均随着贮藏时间的延长而下降， 与贮藏期间总酚及总类胡萝卜素的含量变化一致。——论文作者：赵 凤 梅 潇 张 焱 廖小军 王永涛 *
