摘要: 目的: 运用网络药理学的方法探讨马齿苋药理作用的分子机制。方法: 以“马齿苋”为检索词，在中药系统药理学数据库与分析平台进行检索，根据口服生物利用度及类药性参数查找有效成分及其靶基因，构建有效成分 - 靶点基因网络作用图; 构建蛋白质相互作用( protein - protein interation，PPI) 网络图，筛选出相互作用的核心靶点并对其作用靶点进行 GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析，明确马齿苋具体的作用分子机制。结果: 共筛选出 10 种马齿苋的有效成分、221 个靶点蛋白，靶蛋白 PPI 网络中其中的核心靶点蛋白包括 AKT1、ALB、白细胞介素 - 6( interleukin - 6，IL - 6) 等。富集分析发现马齿苋作用的靶点蛋白多分布于神经突触后膜、细胞质的核周区域及细胞外基质等区域、分子功能涉及蛋白质同源二聚体激活、转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合等; 生物过程富集于对有机环状化合物及有毒物质的反应等; 生物通路包括多条癌症通路、乙型肝炎通路及动脉粥样硬化通路。结论: 马齿苋在抗癌、心血管等方面有潜在的药理作用。
关键词: 马齿苋; 网络药理学; 药理作用
马齿苋，又名长寿菜，为常见的药食同源的中药，来源广，应用广泛，内服用于治疗痢疾，有降糖、降脂等作用[1]，外用可以治疗湿疹、扁平疣和尖锐湿疣等[2 - 3]。其性寒味酸，入大肠、肝、脾经，有清热解毒、消痈利尿之功效，适用于湿热或热毒所致的痢疾、痈肿和淋症等[4]。有研究表明，其性寒滑利，清血分及大肠热毒，为中医临床治痢疾的常用品，有 “痢疾克星”之称[5]。《本草纲目》记载“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋，治产后虚汗”。中药因其成分复杂，靶点众多，应用网络药理学研究中药药理作用的分子作用机制有重要意义。
本研究通过收集整理马齿苋的主要成分和作用靶点，构建成分靶点网络，采用网络药理学的方法分析马齿苋药理作用的分子机制，为寻找马齿苋潜在的药理作用提供了依据。
1 方法
1. 1 活性成分及靶标蛋白的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台( traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP) [6]( http: / /tcmspw. com /tcmsp. php) 检索“马 齿 苋”。口 服 生 物 利 用 度 ( oral availability， OB) ，即口服后药物以原型形式进入血液循环的相对量，是确定药物生物活性，可作为药物的关键指标，筛选值≥30%。类似性( drug - likeness，DL) 是基于相似性原理，总体相似的分子应具有相似的生物活性; DL≥0. 18，即“类药物”化合物的选择标准。根据活性成分在相关靶点中选出相应的靶点蛋白名称。
1. 2 靶蛋白的基因 symbol 确定及成分 - 靶基因网络的构建 通过 UNIPROT [7]数据库( https: / /www. uniprot. org /) 和 GENECARDS [8]( https: / /www. genecards. org /) 数据库将靶点蛋白转化为相应的 gene symbol，采用 Cytoscope3. 6. 0 软件构建成分 - 靶基因网络图。
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1. 3 构建蛋白相互作用( protein - protein interation，PPI) 网络 应用 STRING[9]( https: / /string - db. org /) 数据库构建相关靶蛋白的 PPI 网络，并根据度值筛选核心网络作用图。
1. 4 靶蛋白的富集分析 采用在线富集分析网站 Metascape [10]( https: / /metascape. org /gp /index. html) 对靶点蛋白进行 GO 富集分析和 KEGG 通路富集。
1. 5 实验流程图 见图 1。
2 结果
2. 1 活性化合物的筛选结果 从马齿苋中共筛选出 10 种( 占 54 种化合物的 18. 52% ) 具有良好的口服生物利用度( OB≥30% ) 和类药性( DL≥0. 18) 的化合物。见表 1。
2. 2 化合物 - 靶点相互作用网络 共筛选出靶点 221 个蛋白基因。化合物 - 靶蛋白基因相互作用网络图，见图 2。
2. 3 靶基因相互作用网络( PPI 分析) 及高连接子图筛选 将所有靶基因数据导入 STRING 数据库中进行 PPI 分析，PPI 网络图共 212 个节点，3 898 条边，网络异构度为 0. 808，聚集系数为 0. 585，PPI 富集 P < 0. 001，蛋白相互作用包括共表达、共现、融合、调控和注释途径等相互作用[11]。度值前 10 位节点的拓扑学参数，见表 2。蛋白质网络中节点度值越大，表明该蛋白质参与的相互作用越多，体现了该蛋白质与周围蛋白质之间的直接联系的能力更强，对于蛋白质网络的影响力就越大，该蛋白质是关键蛋白质的可能性越大[12]。度值最高的 AKT1 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一，调节多种过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成[13 - 15]。ALB 为血浆白蛋白，在调节血浆胶体渗透压中起到重要作用，并充当多种内源性分子及外源性药物的载体蛋白[16]。白细胞介素 - 6( interleukin - 6，IL - 6) 参与炎症反应，在急性期参与 B 细胞活化[17]。TP53、 TNF、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8 均参与肿瘤的生成和坏死[18 - 23]。见图 3。
2. 4 靶蛋白基因 GO 富集分析和 KEGG 富集分析 GO 富集分析和 KEGG 通络富集均在 Metascape ( https: / /metascape. org /gp /index. html) 上完成，GO 富集分析包括生物过程( biological progress，BP) 、分子功能( molecular function，MF) 和细胞成分( cellular component，CC) 。选取显著性前 20 位富集结果做气泡图，图 4 为 BP 富集结果，图 5 为 MF 富集结果，图 6 为 CC 富集结果，图 7 为 KEGG 通路富集结果。 MF 富集分析显示了作用靶点多具有与配体激活的转录因子活性、核受体激活、类固醇激素受体激活、铵离子结合、神经递质受体激活等分子功能，BP 富集分析主要包括对有机环状化合物反应过程、对有毒物质反应过程、对无机物的反应过程等; CC 富集分析显示这些靶点蛋白主要分布在突触后膜、细胞质核周区域、细胞外基质等; 主要的通路包括癌症通路、乙型肝炎通路、动脉粥样硬化通路等。说明马齿苋作用范围广泛，通过多种途径调节机体功能，包括肿瘤形成、乙型肝炎、动脉粥样硬化等。
颜色由绿到红为 - log10 ( fdr) 范围从小到大，- lg( fdr) 越大说明显著性越强，fdr 为调整后 P 值，即 q 值) ，气泡大小为富集的基因数目，纵坐标为各个富集的名称，横坐标为富集倍数。
3 讨论
本研究通过对马齿苋的有效成分进行筛选，寻找靶点蛋白，转换成靶点基因，靶基因相互作用和富集分析来研究马齿苋药理作用的分子机制。符合多靶点、多通路和多种分子机制共同作用的条件。有效成分的筛选仅仅从口服生物利用度和参数方面考虑，没有考虑有效成分在马齿苋中的含量浓度，可能会存在一定的误差。
蛋白质不能独立执行生物功能，而是通过相互作用以协作的方式完成生物功能，PPI 在生命活动中起到核心作用。PPI 是互相作用的蛋白质在物理上的接触，形成蛋白质复合物或短暂接触后又发生了分离[24]。通过 PPI 网络分析，发现马齿苋作用的主要蛋白 AKT1 参与炎症、癌症、糖尿病及心血管疾病等的发生发展。研究表明，AKT 信号通路在心肌肥厚和重塑中起着重要作用[25]。马齿苋前 10 的作用靶点分子中除了 AKT1，IL - 6、TNF 也是炎症反应 中重要的细胞因子。IL - 6 是细胞因子网络中重要成员，在急性炎症反应中处于中心地位，可诱导产生 C 反应蛋白和降钙素原生成，与炎性疾病及感染程度直接相关[26]。研究发现，马齿苋可以抑制 IL - 6 表达，抑制溃疡性结肠炎的癌变[27]。前 10 作用分子中其他靶点参与肿瘤发展、细胞分裂等。研究表明，马齿苋中提取的多糖能提高小鼠的免疫功能，同时也可直接抑制肿瘤细胞分裂[28]。有实验发现，马齿苋通过驱邪扶正作用起到抗病毒作用[29]。富集分析结果显示了马齿苋的靶蛋白多参与细胞分裂、转录调节等生物过程。这些研究结果均与基因富集分析结果中靶基因蛋白所参与的多条癌症通路及心血管疾病通路相对应。有研究表明，马齿苋提取液具有抗金黄色葡萄球菌、大 肠 杆 菌、酵 母 菌 等 作用[30]，本研究重点关注于马齿苋在人体中潜在存在的靶点蛋白的作用，其他生物的靶点蛋白不在考虑范围内。
本研究仅分析了马齿苋的作用分子机制，没有把相关疾病靶点映射到其作用靶点中，探讨马齿苋与某种疾病的关系。后续研究要注意把相关疾病与马齿苋作用靶点相互映射，为中药治疗相关疾病的开发提供依据。——论文作者:张伟
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