摘要背景：许多研究证实了生物材料的物理性质尤其是其硬度能够调控干细胞向目的细胞定向分化。目的：综述细胞外基质对干细胞行为的影响及生物材料物理性质调控干细胞分化的最新研究进展。方法：由第一作者检索中国期刊全文数据库和 Web of Science 数据库，检索词分别为 “细胞外基质、生物支架材料、化学性质、物理性质、基质硬度、干细胞分化”和“extracellular matrix, biomaterials scaffolds, chemical properties, physical properties, substrate rigidity, stem cell differentiation”。语言分别设定为中文和英文，最终选择 31 篇文献进行综述。结果与结论：生物材料支架的物理性质能够影响细胞的增殖、迁移和分化等行为，尤其是硬度调控干细胞分化对组织工程及再生医学都具有极大的启示。寻找更多与细胞外基质硬度共同作用的生物化学因素和物理因素，精确控制细胞行为，制备出与体内生理环境更加相似的支架材料值得深入研究和探讨。
关键词：干细胞;材料相容性;细胞外基质;组织工程;生物材料;复合材料;物理性质;基底硬度;定向分化
0 引言 Introduction
干细胞对细胞外基质的固有性质非常敏感，基质弹性诱导干细胞分化的重要性已经成为一种新型的敏感性非常高的细胞调节因素。模拟天然细胞外基质设计的生物材料，不仅为细胞和再生组织提供一个暂时的结构支持，同时也能通过传导必要的生物物理、生物力学和生物化学信号来调节细胞的黏附、增殖、分化以及组织结构的形成。细胞外基质的物理性质，特别是硬度或弹性，能对细胞的黏附、铺展、增殖、迁移和分化等多种功能和行为产生重要影响。研究基质表面弹性对蛋白吸附及干细胞分化和分泌功能的作用，是组织工程用生物材料设计的一个新思路。文章论述了生物材料物理性质对干细胞分化的影响以及模拟细胞外基质物理性质调控干细胞分化行为的最新研究进展，对未来需要重点研究的问题进行了展望。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 文献检索和筛选要求
1.1.1 检索数据库 中国期刊全文数据库(CNKI);Web of Science数据库。
1.1.2 检索数据库的选择理由 Web of Science数据库和中国期刊全文数据库分别是国外和国内最权威的生物医学文献数据库，文献数据多且全面。
1.1.3 检索途径、检索词及各检索词的逻辑关系 为全面、准确地检索出撰写该综述的相关文献，文章写作过程中综合考虑了检索途径的选择、检索词的选择和各检索词间逻辑关系的配置，制定了科学的检索策略。
检索途径：关键词检索、摘要检索、全文检索。
检索词：中文检索词为“细胞外基质、生物支架材料、化学性质、物理性质、基质硬度、干细胞分化”。英文检索词为“ extracellular matrix, biomaterials scaffolds, chemical properties, physical properties, substrate rigidity, stem cell differentiation”。
检索词的逻辑组配：先以“细胞外基质”AND“支架材料”进行检索，然后分别将物理性质，化学性质，基质硬度与干细胞分化匹配进行检索。
1.2 文献筛选流程和筛选标准
1.2.1 文献筛选流程 按照图1的步骤进行。
1.2.2 文献的筛选标准 ①仿生材料的设计研究;②生物材料的物理化学性质对干细胞行为影响的相关研究。
1.2.3 文献的排除标准 ①相似的陈旧的文献;②与此文研究目的不相关文章。
1.2.4 筛选偏离的描述、原因及对结果的影响 该综述所有纳入文章均经组内讨论，以避免存在筛选偏离。
1.2.5 文献筛选结果的输出形式 文献检索和筛选结果的输出采用文献的引用形式，且保持了格式的一致性，文献的引用形式包括作者、题名、期刊名称、发表年代、卷数(期数)、页码等。经筛选纳入评价的文献提供了全文。
2 结果 Results
2.1 细胞外基质对细胞行为的影响 细胞外基质是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间 的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。细胞外基质不仅具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用，而且对细胞的基本生命活动发挥着全方位的生物学作用，如支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动等。细胞和细胞之间，细胞和细胞外基质之间的相互作用以及温度、营养、细胞因子等共同构成的组织环境称为微环境。干细胞的微环境又称为干细胞 Niche(干细胞壁龛) [1]，其在干细胞生长和功能的维持和调节中起到重要的作用。微环境对细胞增殖分化的影响主要有3个方面：①细胞与细胞的相互影响;②细胞与细胞外基质的互相影响;③可溶性信号分子的影响[2]。
干细胞的命运受控于细胞微环境中的信号分子，而细胞外基质是构成细胞微环境的重要因素之一，为细胞提供空间和机械刺激从而引导细胞的行为，细胞与细胞外基质之间的物理作用调节原始细胞程序，包括分化、迁移和增殖[3]。
活细胞对环境的感应有着许多智能系统的特点，一个细胞可以感觉和回应很多化学和物理的外界信号，它可以整合和分析这些信息，从而改变自身的形态、动态行为甚至能改变最后的命运。细胞利用细胞外基质和临近细胞之间构成的信号去建立和维持它们的形状和生理特性，这种多样性在生物系统中常常与细胞的功能紧密联系。细胞必须感应微环境的物理性质，并随着时间推移适当地做出回应，从而来取得细胞功能。当干细胞受到细胞外基质固有性质(如基质结构、表面弹性及组成成分)的影响时，干细胞开始向成熟的组织细胞分化，这些性质可以调节细胞作用于基质的应力。机械敏感通道随后把这些生物物理信息转化成生物信号，这些生物化学信号能促进干细胞的特异性分化。就像加入了生长因子一样，细胞外基质固有性质的作用非常强大，它们可以在时空上控制干细胞的发育，即它们在诱导干细胞分化及组装时起到形态控制的作用。尤其是干细胞的命运和种系分化紧密地依赖于细胞外基质的弹性和表面微观结构。
2.2 仿生材料设计研究 组织工程研究的热点主要集中在3个方面，即种子细胞、支架材料和生物因子。支架材料是组织工程的基础，是组织工程成败的关键因素，它是模拟天然细胞外基质的支架材料，有利于细胞黏附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。
2.2.1 对仿生材料的要求 仿生材料是为细胞组织的生长提供营养和代谢产物的三维多孔结构的载体，是一种仿生的细胞外基质，不仅要有良好的细胞相容性，提供合适的力学强度，而且在结构(二维结构和三维结构)、生化组成和功能上都仿生。因此，选择支架材料时除了符合一般生物医学材料的要求外，组织工程学所需的理想支架材料应尽可能满足以下要求：①生物相容性和表面活性：有利于细胞的黏附，并且具有无毒，不致畸，不引起炎症反应等特点，为细胞的生长提供良好的微环境，能安全用于人体;②生物可降解性：在组织形成过程中逐渐降解，并且具有合适的降解速率，与组织细胞的生长速度相一致，降解时间应能调控;③合适的表面理化性质和较高的比表面积：有利于细胞的黏附、铺展、迁移、增殖、分化等行为产生;④合适的孔径和孔隙率[4]：这样有利于细胞的黏附和组织的生长，促进新生组织向材料内部的长入，利于营养成分的运输和代谢产物的排出;⑤合适的机械强度和可塑性：为新生组织提供支撑的作用，生物材料的机械强度要保持一定时间直至重生组织具有自身生物力学特性。材料被加工成所需的形状，并且在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状。
2.2.2 仿生材料的分类 仿生材料的种类有很多，根据材料的来源可以分为天然生物材料、合成生物材料和复合生物材料。
天然生物材料：天然生物材料直接来源于动植物或人体。由于来自于生物体，所以天然材料具有良好的组织相容性，无明显的毒性，能最终降解为多糖或氨基酸而被机体吸收，并且不易引起炎症反应和免疫反应。按照结构分类主要可以分为：天然蛋白质，如明胶、胶原、弹性蛋白、纤维蛋白;蔡国徽等[5]以胶原Ⅰ为支架材料，建立卵巢癌细胞体外三维培养模型，胶原Ⅰ具有良好的结构与性能，适宜于卵巢癌细胞体外三维培养，并能较好地维持卵巢癌细胞的形态和功能。多糖类物质，如壳聚糖[6]、葡聚糖、糖胺聚糖、细菌纤维素、透明质酸以及其他海藻酸盐等。天然材料的优点在于无抗原性，能够介导细胞间信号传导，也可通过释放活性因子来促进细胞黏附、增殖及分化，具有良好的生物相容性。但是其缺点也很明显，例如难以控制降解速率、物化性质的单一性、较差的重现性和力学性能，使其难以大批量生产，同时异种移植的问题以及异种蛋白成分的存在可能会导致免疫反应等。
合成生物材料：合成材料种类很多，与天然材料相比，除了能克服天然材料的力学性能和重复性差、降解速度和强度不可调节等缺点之外，还具有原始材料来源充足，可以被制成各种所需的形状，构建高孔隙率三维支架，可人为修饰和调控其结构和性能等优点。
根据原始材料的种类可分为：人工合成高分子材料如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚乙内酯 (PCL)、聚丙交酯与聚乙交酯共聚物(PLGA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等;无机非金属合成材料如钙磷陶瓷、羟基磷灰石、生物玻璃、磷酸钙骨水泥、碳材料以及生物惰性的氧化铝和氧化锆等;某些金属材料如镁合金、钛及其合金、镍钛合金等。小鼠诱导多功能干细胞在聚乙内酯静电纺丝纳米纤维支架上具有良好黏附性并呈集落样生长，其增殖能力及干性标记物的表达均不亚于标准对照组;扫描电镜显示，小鼠诱导多功能干细胞在聚乙内酯静电纺丝纳米纤维支架材料上呈现出绒毛状突起的表面结构。结果表明，聚乙内酯静电纺丝纳米纤维支架可促进小鼠诱导多功能干细胞的黏附、自我增殖以及干性维持，两者具有良好的生物相容性，为联合生物支架材料与干细胞构建功能性组织奠定了基础[7]。相较于天然材料，人工合成材料可塑性更佳，不仅具有良好的力学性能，而且具有丰富的加工手段，并可通过相对分子质量调节降解速率。缺点是生物相容性较差、生物活性较低，对细胞亲和力弱，细胞黏附性较差，降解副产物多种多样，降解速率快，产生的大量副产物会改变机体的微环境导致细胞和组织的坏死等[8]。
复合生物材料：单纯应用天然材料或者合成材料制造的组织工程支架，或多或少都存在某些无法避免的缺陷，因此，目前广大学者已将研究重点转移到使用2种或2种以上不同材料相混合的方法来构建复合材料，以克服单一使用某种材料的不足。复合材料是集中多种材料的优点，弥补各自的不足之处。
常见的复合材料主要有：同一类生物材料的复合、不同类别生物材料之间的交叉复合。天然高分子材料之间构建的复合材料，主要是为了使获得的组织工程支架从组分上尽可能与天然细胞外基质相类似。采用胶原-壳聚糖、胶原-透明质酸、壳聚糖-明胶等天然材料构建组织工程支架的研究已有报道。以生物相容性好的壳聚糖作为基质材料，与力学强度较高的聚乳酸复合制备了网络互穿壳聚糖/聚乳酸复合支架。结果证明干态复合材料的压缩强度和模量分别比纯壳聚糖支架提高了6倍和15倍，能够促进骨缺损的愈合[9]。冯超等[10]研究者利用人发角蛋白、丝素蛋白以及明胶在合适比例下制备的改良发角蛋白/丝素蛋白复合材料力学特性最佳，具有更为理想的生物相容性及降解速率，无明显细胞毒性。还有将羟基磷灰石、胶原、聚丙交酯与聚乙交酯共聚物混和制成的所需形状的支架，可为细胞间相互作用及骨连接提供更好的生物条件[11]。 Kikuchi[12]利用滴定法，在合适的温度和pH值条件下，已经成功合成了羟基磷灰石/胶原复合材料，并且该复合材料已经通过日本政府的审批，将会用于需要骨填充的患者身上。王娇娜等[13]利用激光熔融静电纺丝技术制备了聚乳酸/聚乙内酯及聚乳酸/聚乙内酯/纳米羟基磷灰石复合纤维，研究结果表明，复合纤维支架的直径和孔结构具有多样性，纳米羟基磷灰石能够提高聚乳酸/聚乙内酯层压纤维支架的亲水性，改善支架的细胞相容性，增加细胞的附着能力，提高细胞的存活率。
2.3 生物材料的理化性质对细胞行为的影响 在组织工程中，细胞一般都是在模拟细胞外基质的生物支架材料上人工培养扩增诱导植入到体内。细胞在生物支架材料上的生物学行为，如变形、迁移、增殖、分化等都与细胞支架材料间相互作用密切相关。由于细胞与材料间生物理化因素的存在，细胞与支架间的相互作用也就受到多种因素影响。支架的力学性能、化学及生物物理因素能够影响细胞的铺展形态和面积以及细胞间的接触，进一步对细胞的生长、迁移和分化等行为起到重要的调节作用。
2.3.1 生物材料的化学性质对细胞行为的影响 生物材料表面的化学官能团、亲疏水性及带电性影响着黏附在材料表面的细胞。许多研究通过改变材料表面的化学性质，可以改变干细胞在生物材料上黏附、增殖分化及吸附蛋白质构象的能力[14-15]。
生物材料表面的电荷影响着干细胞的分化，Guo 等[16]将带正电的聚烯丙基胺(PAAm)、带负电的聚丙烯酸(PAA)、不带电的聚乙二醇(PEG)用光接枝的方法固定到细胞培养板的表面，然后将骨髓间充质干细胞分别接种到这3种材料表面，在软骨细胞诱导液的培养条件下，带正电的聚烯丙基胺和不带电的聚乙二醇表面支持骨髓间充质干细胞向软骨分化，而带负电的聚丙烯酸表面不能支持骨髓间充质干细胞向软骨分化。材料的化学性质除对蛋白质的吸附和细胞的分化有影响外，同时也是影响细胞黏附生长行为的重要因素。在材料表面加上生物特异性基团如羧基、氨基等，有利于细胞在材料表面的吸附和分化。
Yan等[17]将NH2、COOH、CH3基团接枝到材料表面，由于tallin蛋白是细胞伸展和黏附的加速器，所以他们通过检测tallin蛋白在细胞中的分布来判断官能基团对细胞在材料表面吸附的影响，实验结果显示接枝NH2、 COOH的基片表面的tallin蛋白量多于接枝CH3的基片表面。同时NH2基团有诱导脂肪干细胞向成骨分化的趋势，而苯基和巯基表面可促进脂肪干细胞向软骨细胞方向分化[18]。
本文来源于：《中国组织工程研究》杂于1997年创办，发表组织工程研究中关于干细胞培养与移植、组织构建、材料生物相容性评价(天然或合成材料与纳米粒子、人工材料植入体、植入器官及外源性细胞)、计算机辅助骨外科技术的应用基础及临床研究，转化医学和循证医学研究的文章，发表中国组织工程研究领域一流水平的学术、技术创新成果。
2.3.2 生物材料的物理性质对细胞行为的影响 由于细胞与材料间生物物理因素的存在，细胞与支架间的相互作用也就受到多种因素影响，包括基质的硬度、表面形貌以及细胞所受的外力等力学因素[19]。有研究表明不同硬度的基质材料可以诱导间充质干细胞向不同谱系细胞分化。基质硬度不仅影响细胞形态，也影响了细胞基因的表达[20-21]。模拟不同组织硬度的细胞外基质均能诱导干细胞分化成不同类型的细胞。
Engler等[20]在表面修饰Ⅰ型胶原蛋白且硬度不同的聚丙烯酰胺水凝胶上分别培养人骨髓间充质干细胞，实验结果显示，在没有诱导因子的条件下，将人骨髓间充质干细胞培养在模拟脑组织硬度的软凝胶(0.1- 1.0 kPa)上，骨髓间充质干细胞向神经细胞方向分化;将骨髓间充质干细胞培养于模拟肌肉组织硬度的较硬凝胶(8-17 kPa)上，骨髓间充质干细胞向肌细胞方向分化;当硬度进一步增加，将骨髓间充质干细胞培养于模拟类骨质硬度的水凝胶(25-40 kPa)上时，骨髓间充质干细胞呈现与成骨细胞相似的多角形，并且成骨细胞标志分子RUNX2表达水平上调，表明骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。
Xue等[22]通过调整丙烯酰胺(Acrylamide)、交联剂 (Cross-linker)、双丙烯酰胺(Bis-acrylamide)的相对浓度来调节基底硬度，将骨髓间充质干细胞分别接种到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶基底上，结果显示成骨分化标记基因ALP，Col1α1，Runx2 mRNA水平在硬基底(40.0±3.6) kPa上明显升高，表明基底硬度就能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化;另外软骨分化标记基因SOX-9，Aggrecan，Collagen Ⅱ和Collagen Ⅹ 的mRNA水平在软基底(1.6±0.3) kPa上显著升高， SOX9蛋白表达在软基底上明显升高，Alcian blue染色和Collagen Ⅱ免疫荧光染色结果均显示软基底更有利于软骨分化。此外，不仅单一的细胞外基质硬度影响着间充质干细胞的分化，硬度梯度也能在间充质干细胞分化中发挥作用。
Navaro等[23]将髓核间充质干细胞分别接种到2种不同弹性模量 TF 水凝胶 (tetronic 1307- fibrinoge hydrogel)上，弹性模量G0=1 kPa的基底促进软骨的形成，而弹性模量G0=2 kPa的基底有利于向成骨细胞分化。无论在生理还是在病理上，机体内组织和器官的硬度都存在一定的梯度，因此梯度硬度也能在间充质干细胞分化中发挥作用。
Kim等[24]制备刚度是沿纵向从顶部1 kPa到底部 24 kPa的方向逐渐增加的圆柱形聚乙烯醇水凝胶，将骨髓间充质干细胞接种到水凝胶上，其中软基底和硬基底分别有效促进了神经分化和成骨分化。Tse等[25] 通过构建细胞外基质硬度梯度的聚烯丙基胺凝胶，发现多数间充质干细胞具有向细胞外基质硬度较大方向迁移的趋势，并分化为成肌细胞。另外，Sharma等[26] 利用聚烯丙基胺凝胶模拟类骨质的硬度范围，构建了4 种硬度梯度的基质，其中70-90 kPa梯度的基质能诱导间充质干细胞表达成骨细胞标志分子RUNX2和碱性磷酸酶，在硬度梯度为10-90 kPa纤连蛋白表面修饰的基质中，硬度大于20 kPa的区域有钙结节形成，说明间充质干细胞向成骨细胞分化。细胞外基质硬度不仅能促进间充质干细胞分化，还可以促进胚胎干细胞向特定细胞分化。
Arshi等[27]将胚胎干细胞培养在含不同比率单分子交联剂的聚二甲基硅氧烷(PDMS)基质上，实验结果显示，硬性的细胞外基质促进胚胎干细胞向心肌细胞分化。此外，基质硬度可以维持胚胎干细胞的干性。 Park等[28]研究发现，间充质干细胞在硬基质上的伸展性和增殖能力都明显比软基质上减弱，在硬基质上生长的间充质干细胞更趋向于向成骨细胞分化，而软基质上生长的间充质干细胞向成软骨方向和成脂方向的分化比例明显高于硬基质上的间充质干细胞。软基质对于Rho诱导的应力纤维的形成和α-actin的装配没有明显的影响。进一步的分析表明间充质干细胞在软基质上的黏附力比硬基质明显减弱，这可能是基质软硬度对于干细胞分化影响的主要机制。
3 小结 Conclusion
生物材料支架的物理性质能够影响细胞的增殖、迁移和分化等行为[29-31]，尤其是硬度调控干细胞分化对组织工程及再生医学都具有极大的启示。目前，对于细胞外基质硬度调控干细胞分化还有许多方面需要深入的探讨，如除了材料硬度这一因素能调控干细胞分化外，还有其他物理因素、化学因素影响着干细胞的分化，材料硬度单独诱导分化的细胞在形态、结构和功能等方面与正常的成熟细胞相比有较大的差异，因此需要寻找更多与细胞外基质硬度共同作用的生物化学和物理因素，精确控制细胞行为。如何能够制备出与体内生理环境更加相似的支架材料值得深入研究和探讨。
组织工程生物材料支架的最终目的是用于临床治疗，组分上尽可能与细胞外基质相类似，减小与体内环境的差异性。除此之外，还要必须考虑一些在设计和制备中的实际问题，如材料的机械性能是否有利于实际应用的操作，材料是否容易消毒，材料是否可以大规模加工生产，是组织工程材料能够用于临床的根本目的。——论文作者：郑力恒1，2 ，吴 昊2，3 ，尚玉攀4 ，张嘉晴4
