摘要: 对多粘类芽孢杆菌菌株 B - 306 的培养基配方及培养条件进行优化研究，优化后的多粘类芽孢杆菌 B - 306 培养基配方及培养条件为: 可溶性淀粉 17. 5 g·L - 1 、蛋白胨 25. 0 g·L - 1 、NaCl 1. 25 g·L - 1 、Na2HPO4 0. 5 g·L - 1 、CaCl2 1. 0 g·L - 1 ，pH7. 5; 培养温度 30 ℃、转速 170 r·min - 1 、装液量 80 mL/250 mL; 接种量为 10% ( 体积分数) . 经过以上条件优化，多粘类芽孢杆菌 B - 306 的细胞生物量可达 5. 3 × 109 cfu·mL - 1 ，比优化前 ( 3. 17 × 108 cfu·mL - 1 ) 提高了 15. 72 倍.
关键词: 多粘类芽孢杆菌; 培养基配方; 培养条件; 优化
0 引言
多粘类芽孢杆菌( Paenibacillus polymyxa) 是一种产芽孢的 G + 细菌，对人或动植物没有致病性，可产生多肽抗生素[1]、拮抗蛋白[2]、酶[3]、植物激素、絮凝剂[4]等多种生物活性物质，兼有生物农药和生物菌肥的作用，已广泛应用于农业[5]、工矿业[6]及废水处理[7]等领域. 美国环境保护署( EPA) 已将其列为可在商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种[8].
多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌[9]，一方面可以用作微生物肥料，促进植物生长、提高作物产量[10 - 11]; 另一方面，可以有效防治植物细菌性和真菌性土传病害，对植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等[12 - 13]多种植物病害具有很好的防治效果. 多粘类芽孢杆菌产生的多肽类抗菌物质对植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性质比较稳定，可用于多种植物病害的生物防治[14]. 因此，多粘类芽孢杆菌是一类极具开发前景和应用价值的生防细菌. 本研究对多粘类芽孢杆菌 B - 306 的培养基配方及培养条件进行优化，以提高多粘类芽孢杆菌 B - 306 的菌体产量.
1 材料与方法
1. 1 菌种
菌株 B - 306，本课题组从甘蔗渣田地中筛选获得，并经鉴定为多粘类芽孢杆菌.
1. 2 牛肉膏蛋白胨培养基( g /L 蒸馏水)
牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 ～ 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7. 0 ～ 7. 2，121 ℃灭菌 20 min. ( 液体培养基不加琼脂，其他成分一样)
1. 3 主要仪器设备
超净工作台( SW - CJ - 2FD 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ; 手提高压蒸汽灭菌锅( 01J2003 - 04 型，上海东亚压力仪器制造有限公司) ; 隔水式生化培养箱( SHP - 250 型，上海精密实验设备有限公司) ; 气浴式恒温摇床( DHZ - DA 型，太仓市实验设备厂) ; 可见分光光度计( V - 1200 型，上海美谱达仪器有限公司) ; pH 计( PHS - 3C 型，上海精密科学仪器有限公司) .
1. 4 实验方法
1. 4. 1 多粘类芽孢杆菌生长曲线测定
多粘类芽孢杆菌在 37 ℃下经牛肉膏蛋白胨培养基活化培养 24 h 后，以 5% ( 体积分数) 量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基( 100 mL /250 mL) 中，在 30 ℃、200 r·min - 1 下培养，分别采用平板菌落计数法和分光光度法( 600 nm) 跟踪测定多粘类芽孢杆菌 B - 306 细胞生物量( 单位为 cfu·mL - 1 : 菌落数/mL) 的变化情况，重复 3 次，取平均值，从而确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 的生长曲线.
1. 4. 2 培养基成分的优化
1) 碳源种类对菌种细胞生物量的影响. 以液体牛肉膏蛋白胨培养基为基础，选择不同的碳源( 蔗糖、环糊精、麦芽糖、淀粉、乙酸钠、葡萄糖) ，分别制成含 10 g·L - 1 单一碳源的培养基( 100 mL /250 mL) ，再将菌悬液以 5% ( 体积分数) 接种量接种到培养基中，置于30 ℃、200 r·min - 1 下培养18 h. 以 OD600增长量 ( 即菌种培养后 OD600值与菌种初始 OD600值之差) 为指标，每个实验做 3 个平行( 下同) ，取平均值从而确定最佳的碳源种类.
2) 碳源添加量对菌种细胞生物量的影响. 在确定了最佳碳源种类的基础上，考察 7. 5、12. 5、15、 17. 5、20、25 g·L - 1 不同碳源添加量对多粘类芽孢杆菌 B - 306 生长的影响，以 OD600增长量为指标，从而确定最佳的碳源添加量.
3) 氮源种类对菌种细胞生物量的影响. 在碳源优化的基础上，选择不同的氮源( 蛋白胨、磷酸二氢铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠) ，分别制成含 10 g·L - 1 单一氮源的培养基，以 OD600增长量为指标，从而确定最佳的氮源种类.
4) 氮源添加量对菌种细胞生物量的影响. 在确定最佳氮源种类的基础上，考察 2. 5、5、7. 5、10、 12. 5、15、17. 5、20、22. 5、25、27. 5、30 g·L - 1 不同氮源添加量对多粘类芽孢杆菌 B - 306 生长的影响，以 OD600增长量为指标，从而确定最佳的氮源添加量.
5) 无机盐种类对菌种细胞生物量的影响. 在碳源和氮源优化的基础上，分别以 5 g·L - 1 的磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、钼酸钠、氯化锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁为无机盐添加到培养基中，以 OD600增长量为指标，从而确定最佳无机盐.
6) 无机盐添加量对菌种细胞生物量的影响. 采用正交试验设计法，探讨对菌体生长作用明显的无机盐配比及其交互作用对菌株 B - 306 细胞生物量的影响. 按照 L9 ( 34 ) 正交试验表配制培养基，以 OD600增长量为指标，从而确定作用比较明显的无机盐的添加量.
1. 4. 3 培养条件的优化
1. 4. 3. 1 培养基初始 pH 对菌种细胞生物量的影响
在碳源、氮源和无机盐优化的基础上，调节多粘类芽孢杆菌 B - 306 的液体培养基初始 pH 分别为 4. 0、5. 0、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0，以 OD600增长量为指标，确定液体培养基的最佳初始 pH 值.
1. 4. 3. 2 温度对菌种细胞生物量的影响
在培养基成分优化的基础上，将多粘类芽孢杆菌 B - 306 分别置于 25、30、35、40、45 ℃ 下，在 200 r·min - 1 条件下培养，以 OD600增长量为指标确定最佳培养温度.
1. 4. 3. 3 溶氧对菌种细胞生物量的影响
1) 转速. 将多粘类芽孢杆菌 B - 306 以 5% 的量接种到已优化培养基成分的液体培养基中，置于 30 ℃，分别在 100、130、170、200、230、260 r·min - 1 的转速下培养，以 OD600增长量为指标确定最佳转速.
2) 装液量. 在培养基成分以及温度优化的基础上，分别选取 40、60、80、100、120、140 mL /250 mL 不同的培养基装液量，将多粘类芽孢杆菌 B - 306 置于30 ℃，转速200 r·min - 1 ，以 OD600增长量为指标确定最佳装液量.
1. 4. 3. 4 培养条件正交试验
采用正交实验设计法，探讨温度、转速、装液量、培养基初始 pH 对菌种生长的影响，按照 L27 ( 313 ) 正交试验表配制培养基，在相应的条件下培养，以 OD600增长量为指标确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 最佳培养条件.
1. 4. 3. 5 接种量对菌种细胞生物量的影响
在培养基成分和培养条件优化后的基础上，将活化好的种子液分别以 1% 、3% 、5% 、10% 、15% 、 20% ( 体积分数) 的接种量接种到液体培养基中，以 OD600增长量为指标确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 最佳接种量.
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2 结果与分析
2. 1 多粘类芽孢杆菌生长曲线的测定测定
不同培养时间下 OD600值和菌落数，以培养时间为横坐标、分别以 OD600值和菌落数为纵坐标绘制生长曲线图( 图 1) . 由生长曲线确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 的最佳培养时间为 18 h.
2. 2 多粘类芽孢杆菌的培养基优化
2. 2. 1 碳源种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
分别以蔗糖、环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、乙酸钠、葡萄糖为碳源，考察它们对多粘类芽孢杆菌 B - 306 细胞生物量的影响，以碳源种类为横坐标，OD600增长量为纵坐标作图( 图 2) . 由图 2 知，以可溶性淀粉为碳源时，多粘类芽孢杆菌的 OD600增长量最大，为 1. 184; 而用乙酸钠和葡萄糖作为碳源时，OD600 增长量较小. 综合细胞生物量和培养基成本进行考虑，确定采用可溶性淀粉作为碳源.
2. 2. 2 碳源添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
比较可溶性淀粉不同添加量对多粘类芽孢杆菌 B - 306 生长的影响，以碳源添加量为横坐标，OD600增长量为纵坐标作图( 图 3) . 结果表明，随着可溶性淀粉添加量的增加，OD600增长量也不断提高，当碳源添加量为 17. 5 g·L - 1 时，多粘类芽孢杆菌的 OD600增长量达到最高，为 0. 982. 随之继续增加可溶性淀粉的添加量，OD600增长量缓慢下降. 因此，确定多粘类芽孢杆菌可溶性淀粉的最适添加量为 17. 5 g·L - 1 .
2. 2. 3 氮源种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
氮源为微生物生长提供营养所需的氮元素，氮素对微生物的生长发育有着重要的意义，主要用于菌体细胞物质( 氨基酸、蛋白质、核酸等) 和含氮代谢物的合成. 有机氮源营养丰富，除含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸以外，还含有少量的糖类、脂肪和生长因子等. 由于有机氮源成本较高，本研究主要以无机氮源为主，以氮源种类为横坐标，OD600增长量为纵坐标作图( 图 4) . 结果表明，菌种利用蛋白胨作为氮源时，OD600增长量最高，为 0. 942; 而采用无机氮源时，细胞生物量相对较低，因此选取蛋白胨作为培养基的氮源.
2. 2. 4 氮源添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
以蛋白胨添加量为横坐标，以菌悬液稀释 10 倍后的 OD600增长量为纵坐标作图( 图 5) . 结果表明，随着蛋白胨添加量的增加，OD600增长量也随之提高; 当蛋白胨添加量为 25. 0 g·L - 1 时，多粘类芽孢杆菌的 OD600增长量达到最高，为 0. 679; 随后继续增加蛋白胨的添加量，OD600增长量有所下降. 因此，确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 的蛋白胨添加量为 25. 0 g·L - 1 .
2. 2. 5 无机盐种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
以无机盐种类为横坐标，以菌悬液稀释 10 倍后的 OD600增长量为纵坐标作图( 图 6) . 结果表明，当以 NaCl、Na2HPO4 和 CaCl2 作为无机盐时，多粘类芽孢杆菌的 OD600 增长量较大，分别为 1. 101、0. 825、 0. 748，因此选择 NaCl、Na2HPO4 和 CaCl2 作为多粘类芽孢杆菌 B - 306 培养的最佳无机盐. 在确定最佳无机盐种类的基础上，进一步深入研究无机盐的最适添加量及其相互作用.
2. 3 多粘类芽孢杆菌培养条件的优化
2. 3. 1 培养基初始 pH 值对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响以培养基初始 pH 值为横坐标，以菌悬液稀释 10 倍后的 OD600增长量为纵坐标作图( 图 7) . 结果表明，随着培养基初始 pH 值的升高，其 OD600增长量也随之增加; 当在 pH7 ～ 8 内时，多粘类芽孢杆菌的 OD600增长量都较高，当 pH 值为 7. 5 时，达到最高，为 0. 616. 继续升高培养基 pH 值，OD600增长量下降，因此，确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 的最佳培养基初始 pH 值为 7. 5. 2. 3. 2 温度对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响温度是影响微生物生长的重要因素，它的改变会影响微生物体内所进行的多种生物化学反应. 温度对微生物的影响是广泛的，在一定范围内，适宜的温度能促进生长，不适的温度会改变微生物的形态和代谢. 以培养时间为横坐标，以菌悬液稀释 5 倍后的 OD600增长量为纵坐标作图( 图 8) . 结果表明，当温度为 30 ℃时， 多粘类芽孢杆菌的 OD600值最高，为 0. 610. 因此，确定 30 ℃为多粘类芽孢杆菌 B -306 的最适培养温度.
2. 3. 3 溶氧对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
2. 3. 3. 1 转速对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
溶氧对于微生物的生长和代谢产物的积累有重要的影响，它主要从两个方面来考察，即转速和培养基装液量. 以转速为横坐标，以菌悬液稀释 10 倍后的 OD600增长量为纵坐标作图( 图 9) . 结果表明，随着转速的增加，多粘类芽孢杆菌的 OD600增长量上升，当转速为 170 r·min - 1 时，OD600增长量达到最大值，为 0. 620. 当继续增加转速到 200 r·min - 1 时，OD600增长量开始下降. 因此，选择 170 r·min - 1 为多粘类芽孢杆菌 B - 306 培养的最佳转速.
2. 3. 3. 2 培养基装液量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
以培养基装液量为横坐标，以菌悬液稀释 10 倍后的 OD600增长量为纵坐标作图( 图 10) . 结果表明，装液量对菌种的生长影响不大，当装液量为 80 mL /250 mL 时，OD600的增长量最高，为 0. 861，因此，选择 80 mL /250 mL 作为培养基的初始装液量.
2. 3. 4 培养条件正交试验
设计正交试验 L27 ( 313 ) 对多粘类芽孢杆菌 B - 306 的培养条件进行优化，以考察温度、培养基初始 pH、转速、装液量四个因素对菌株生长的影响，根据单因素的实验优化结果选取因素水平，正交试验设计及分析见表 3、表 4 和表 5.
从表 5 可以看出，温度对多粘类芽孢杆菌 B - 306 的生长具有显著性影响，其他三个因素影响不显著. 从表 4 中可以看出，影响菌体生长的最佳组合为 A2B2C2D2，而正交表中 OD600增长量最高的为 A2B2C2D1，两种组合的差别在于装液量的多少之差，因此从节约生产成本的出发点考虑，选择 A2B2C2D2 为 最 佳 组 合，即 温 度 30 ℃，pH7. 5，转 速 170 r·min - 1 ，装液量 80 mL /250 mL.
2. 3. 5 接种量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
以接种量为横坐标，以菌悬液稀释 10 倍后的 OD600 增长量为纵坐标作图( 图 11) . 结果表明，接种量为 10% ( 体积分数) 时，OD600增长量最大，为 0. 584. 因此，确定多粘类芽孢杆菌 B - 306 的最佳接种量为 10% .——论文作者：陈小煌1 ，李自然1 ，黄小云1 ，叶秀云1 ，刘 波2 ，林 娟1
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