摘 要：生物反应器大规模培养技术在生物制剂领域和医学领域发挥着至关重要的作用，生物反应器大规模培养动物细胞的方法有微载体培养、片状载体培养和全悬浮培养等，与传统的动物细胞大规模培养工艺相比有明显的技术优势。本文主要分析了动物细胞生物反应器大规模培养技术的研究进展，以供参考。
关键词：生物反应器;微载体;片状载体;全悬浮培养
动 物 细 胞 的 大 规 模 培 养(large-scale culture)是通过使用生物反应器在精确控制温度、溶氧、pH 等条件下实现的 [1]，该技术在生物制剂的生产中发挥着重要作用。动物细胞大规模培养生产的产品包括蛋白质药物、单克隆抗体、病毒疫苗等。近几十年来，动物细胞生物反应器大规模培养技术有了很大的发展，在传统的生物反应器的设计上做了很多重要的改进，并且开发了多种新型的生物反应器，例如：多功能膜生物反应器、Couette-Taylor 生物反应器等。生物反应器所需达到的两个最主要的目标，一是通过高密度培养动物细胞增加产量，生产高价值的蛋白质药剂或临床病毒载体 ;二是创造一个类似于体内环境的三维空间来增殖传统培养系统中难以培养的有价值细胞。动物细胞生物反应器大规模培养常用的方法有微载体培养、片状载体培养和全悬浮培养，其技术的主要进展情况综述如下。
1 微载体培养
微载体培养是融合悬浮培养优点的一种特殊的细胞贴壁培养模式。细胞微载体培养的基本特征是细胞贴附于微载体的表面并随微载体悬浮于细胞培养液中。随着生产需求的增长，微载体培养细胞很容易放大，多孔微载体是一种新型的微载体，细胞可以生长在其表面和内部，这在很大程度上增大了细胞的生长面积。适合微载体大规模培养的细胞有 Vero、BHK21、 MDCK、Marc-145、PK15等。
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以交联葡聚糖为基质材料的实体微载体- Cytodex-1和 Cytodex-3是 Vero 细胞培养中使用最多的微载体。Cytodex-3是由变性胶原包被交联葡聚糖基质构成的，1 g Cytodex-3提供的表面积约为 2 700 cm2 ，细胞总量可达 4.6×108 个，且对细胞具有良好的相容性。Cytodex-1交联葡聚糖为基质时，表面包裹有带正电荷的 N，N二乙基氨基乙基(DEAE)基团使细胞更适合于细胞贴附生长。1 g Cytodex-1细胞生长面积约为 4 400 cm2 ，细胞总量可达 6×108 个。1967年出现了微载体细胞培养，20世纪 80年代巴斯德研究所用1 000 L 规模的生物反应器微载体培养 Vero 细胞生产脊髓灰质炎疫苗和人用狂犬病疫苗，目前巴斯德研究用微载体培养的 Vero 细胞在搅拌式生物反应器中生产流感疫苗，其细胞培养工艺在8个周内就可以将复苏的细胞放大到 6 000 L 的规模 [2]。搅拌式生物反应器通过灌注培养技术利用微载体或多空载体细胞密度最终可以达 107 个 /ml 以上。
2 片状载体培养
片状载体是无纺聚酯纤维片，属于一种细胞贴壁载体，具有很大的比表面积 (1 200 cm2 .g-1)，可以多次使用。自 20世纪 90年代中期美国的 NBS 公司推出片状载体 (FibraCel) 和固定蓝式搅拌系统以来，相关的产品设备已广泛应用于基因药物治疗、病毒性疫苗和细胞分泌物等生物制品及医药产业的实际生产中。
固定床式生物反应器用片状载体大规模培养 293T 细胞增殖慢病毒的工艺中，在1.5 L 反应器中加入 50 g 片状载体，按 8.0×105 个 /mL 接种，当细胞培养3 d 时，细胞密度达1×107 ～ 1.5×107 个 /mL[3]。用14 L 篮式生物反应器培养 Vero 细胞生产人用狂犬病疫苗时(片状载体500 g)，按10 L 培养液接种5.0×109 个 Vero 细胞，灌流培养使培养液中葡萄糖含量保持在1.0 g/L 以上，直至细胞生长进入平台期，葡萄糖消耗量为240 ～ 420 g，细胞接种96 h 后达对数生长期，根据消耗的葡萄糖量计算细胞总数 , 培养156 h 后细胞密度可达 1.0×107 个 /ml[4]。
3 全悬浮培养
细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是目前国际上生物制品生产的主流模式。动物疫苗生产的核心环节就是病毒抗原的生产制造，传统的转瓶或鸡胚工艺生产效率低、劳动强度大、批间差异大，这些先天的缺点导致产品质量差，成本居高不下，已经不能满足规模化养殖客户的需求。生物反应器以其规模大、生产效率高、产品批间差异小的优势在口蹄疫行业一经应用便迅速得到推广，目前口蹄疫疫苗行业已经全部实现了生物反应器大规模悬浮培养。禽流感、狂犬、圆环等越来越多的疫苗品种正在试图采用悬浮培养技术，它已经成为了企业转型升级的一把利器。
生物反应器悬浮培养 BHK21细胞生产口蹄疫病毒是口蹄疫疫苗生产最普遍的方式 [5]。印度生产口蹄疫疫苗使用8 000 L 的生物反应器，中国和南美用3 000 ～ 5 000 L 的生物反应器生产口蹄疫疫苗。2009年，默克密理博和北京清大天一科技有限公司开发了 BHK21无血清培养基。 2010年兰州百灵公司和宜兴赛尔公司开发了适合口蹄疫疫苗生产的无血清培养基，使合作企业取得了无血清悬浮培养 BHK21细胞的口蹄疫疫苗生产批文。中空纤维生物反应器主要用于动物细胞无血清悬浮培养，这种生物反应器的主要优势在于营养不间断供应，从而防止代谢物的积累，在这样的条件下培养细胞密度可达 109 /ml，因此中空纤维生物反应器应用很广泛。
4 结语
贴壁培养型细胞可采用转瓶培养、微载体培养、片状载体篮式培养等，其中篮式培养操作简单易控，可培养高密度生长的细胞，一般情况下，微载体培养细胞可扩增 10倍 [6，7]，而篮式培养可达 20倍左右 [8，9]。片状载体可吸附脱落的细胞和宿主蛋白，易得到高质量的收获液 [10]，缺点是难以放大，目前国内各企业均采用罐群进行规模化生产。悬浮培养是细胞大规模培养的努力方向，但是细胞驯化和个性化培养基设计和优化技术难度较大。
动物细胞生物反应器大规模微载体培养时，有很多因素影响动物细胞的高密度增殖，包括 pH、温度、溶解氧、营养素消耗、代谢物积累、血清、生长因子、细胞外基质、剪应力和细胞凋亡等。生物反应器通常具有探针或传感器自动检测活细胞的生长环境，对上述限制性因素实行计算机自动控制，包括通气量、搅拌速度、悬浮均匀程度、pH 稳定性、温度变化、罐压、培养体积及溶氧供应等参数。细胞的培养环境直接影响产品的质量和数量，因此生物反应器的在线控制发挥着很重要的作用。——论文作者：阿尔祖古丽·阿依丁1 ，阿依木古丽1 ，乔自林1 ，马桂兰2*
参考文献：
[1] Garcia-Ochoa F,Gomez E.Bioreactor scale-up and oxygen microbial processes:An overview[J]. Biotechnology Advances,2009,27(2):153-176.
[2] 孙明波 . 使用微载体生物反应器技术制备 Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗的研究及其产品有效性及安全性的研究分析 [D]. 北京 : 北京协和医学院 ,2015.
[3] 徐文涛 , 解国放 , 解正刚 . 应用固定床式生物反应器大规模制备慢病毒 [J]. 中国生物制品学杂志 ,2018,(1):73-76.
[4] 杨屹 , 汝东宇 , 郭秀侠 , 等 . 应用篮式生物反应器制备 Vero 细胞人用狂犬病疫苗 [J]. 中国生物制品学杂志 ,2011,(5):583-585.
[5] Palomares L A,Ramirez O T.Bioreactor scale-up[J].Encyclopedia of Cell,2000,1(4):183-201.
[6] Altman GH,Horan RL,Weitzel P,et al.The use of long-term bioresorbable scaffolds for anterior cruciate ligament repair [J].J Am Acad Orthop Surg,2008,16(4):177-187.
[7] HandlM,DrzíkM,Cerulli G,etal.Reconstruction of the anteriorcruciate ligament:dynamic strain evaluation of the graft[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2007,15(3):233-241.
[8] Kartus J, Movin T, Karlsson J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts [J].Arthroscopy the Journal of Arthroscopic & Related Surgery,2001,17(9):971-980.
[9] Nau T,Lavoie P,Duval N. A new generation of artificial ligaments in reconstruction of the anterior cruciate ligament. Two-year follow up of a randomised trial[J].J Bone Joint Surg Br,2002,84(3):356-360.
[10] Atthoff B,Hilborn J.Protein adsorption onto polyester surfaces:is there a need for surface activation[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2007,80(1):121-130.
