摘 要 猕猴桃种植年限增加导致的连作障碍使土壤微生物结构失调、土壤酶活性及理化指标降低，进而严重降低了猕猴桃品质和产量.在大田试验条件下，本研究以果农传统施肥为对照，探究两种对猕猴桃幼苗有促生作用的微生物肥料 JF 和 KF( 通过无菌苗试验验证促生效果) 对猕猴桃不同生育时期( 发芽期、开花期、果实膨大期、果实成熟期、次年发芽期) 土壤微生物结构、土壤酶活性、理化指标以及果实品质的影响.结果表明: 两种微生物肥料均能显著提高猕猴桃果园土壤细菌、放线菌与真菌的比值，改善和平衡土壤微生物群落结构; 同时显著提高猕猴桃果园土壤酶活性，其中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和多酚氧化酶较对照分别高 17.9% ～ 83.5%、7.9% ～ 83.0%、7.3% ～ 45.4%和 8.1% ～ 140.3%; 增强土壤肥力( 速效氮、磷、钾、全氮、全磷、全钾、有机质含量显著提高) ，降低土壤 pH( 较对照下降 0.29 ～ 0.34 个单位) .施用微生物肥料后猕猴桃果实维生素 C、可溶性糖、可溶性蛋白等含量升高，可滴定酸含量下降.因此施用两种微生物肥料均能平衡土壤微生物群落结构，增强土壤肥力，提高猕猴桃果实品质.该研究结果可为微生物肥料在高龄猕猴桃果园的应用提供有力的理论依据.
关键词 猕猴桃; 微生物肥料; 土壤酶; 土壤理化性质; 品质
近几年我国猕猴桃种植面积不断增长，世界近半的猕猴桃种植区在我国，仅陕西省栽培猕猴桃的面积高达 8667 hm2[1]，超过了除中国以外的世界上最大猕猴桃商品生产国新西兰.猕猴桃作为陕西省的一项支柱产业，已成为农户的重要经济来源，但随着栽植时间的不断延伸及连作障碍的影响，猕猴桃园区土壤各项营养指标日趋恶化.人们习惯大量使用化学肥料来保证作物高产，因此陕西猕猴桃果园存在严重的过量施肥现象，化肥施用量远远高于专家推荐量[2].随着化学肥料和农药的普及，其对环境安全和人类健康日益构成威胁，微生物肥料作为生物技术发展和农业生产的一类重要肥源再次引起人们的重视，成为国内外研究的热点[3].
微生物肥料是指由单一或多种特定功能菌株，通过发酵工艺生产的能为植物提供有效养分或防治植物病虫害的微生物接种剂，又称菌肥、菌剂、接种剂[4].微生物肥料能够活化并促进植物对营养元素的吸收，产生多种生理活性物质并提高植物的抗逆性，因此微生物肥料的开发和应用对中国农业可持续发展具有重要作用[5].在土壤中，微生物能够进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质分解和养分转化，在农业生产中发挥着越来越明显的生态效益[6].
目前，虽然已有一些学者研究证明了微生物肥料对作物的促生和土壤的改良作用，但这些研究主要集中在香蕉、西红柿和辣椒等作物上[7-9]，而微生物肥料对猕猴桃( Actinidia chinensis) 土壤改良和产量提高等方面的研究较少，尤其对猕猴桃生育期内土壤养分系统的动态影响尚未见报道.本研究中的微生物肥料自配制完成后在多种作物上进行了验证，包括辣椒、小麦、甜瓜等，均取得了明显的增产和改善效果.而本试验是将生物肥料先施用到猕猴桃幼苗土壤中，观察到其对猕猴桃幼苗生长有明显的促进作用; 然后再将其施加到高龄果树土壤中以观察其对高龄猕猴桃果园不同时期土壤酶活性及营养状况的影响，为微生物肥料在猕猴桃上的应用提供一定的理论依据.
1 材料与方法
1. 1 微生物肥料
供试菌株为本实验室前期分离鉴定的枯草芽孢杆菌 C3( Bacillus subtilis) 和解磷细菌 YL6( Bacillus cereus) [10].含菌株 YL6 的微生物肥料( JF) 是 YL6 的 LB 液体发酵液，有效菌数为 1.4×1010 CFU·mL-1 ，含氮量 2.5%.含菌株 C3 的微生物肥料( KF) 是本实验室制成的菌剂，有效菌数为 2.4×108 CFU·g-1 ，含氮、磷、钾量分别为 2.0%、1.1%、1.5%.以上微生物肥料符合国家菌肥生产标准( GB 20287—2006) [11]农用微生物菌剂之要求. LB 液体培养基配方: 蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，用 1 mol·L-1 的 NaOH 调节 pH 值到 7.0，定容至 1 L.
1. 2 研究区概况
试验于 2016 年 3 月至 2017 年 3 月在陕西省眉县金渠( 34.21° N，107.81° E) 进行.供试猕猴桃品种为‘秦美’，树龄 20 年，株行距 3 m×4 m.供试土壤基本理 化 性 质 为: 0 ～ 20 cm 土 层 含 有 机 质 29. 5 g·kg-1 ，全氮 0. 2 g·kg-1 ，全磷 3. 1 g·kg-1 ，全钾 2.6 g·kg-1 ，硝 态 氮 13. 6 mg · kg-1 ，铵 态 氮 7. 4 mg·kg-1 ，速 效 磷 149. 0 mg · kg-1 ，速 效 钾 0. 2 g·kg-1 ，pH 7.97.
1. 3 试验设计与样品采集
于 2016 年 3 月 29 日( 发芽期) 布置试验，随机选取园内长势一致的健康植株 15 株，每组随机选取 5 株进行以下处理: 每株单施微生物肥料 JF 500 mL ( JF) ; 每株单施微生物肥料 KF 500 g( KF) ; 同时以农户传统施肥方式( 三帝掺混肥 25-10-5，含氮 25%、 P2O5 10%、K2O 5%，施肥量为每株 1. 5 kg) 为对照 ( CK) . 采用开沟环施法，沟距离根茎 50 cm、沟深 15 ～ 20 cm，将不同处理的肥料均匀撒入后再将土均匀回填.随后的田间管理由农户统一进行.
在猕猴桃各生长时期采用三点取样法采集 15 ～ 20 cm 深的根系土，取部分鲜土测定土壤微生物群落结构，其余土风干后过 100 目筛测定土壤酶活性及理化性质.各生长时期取样日期分别为: 发芽期2016 年 3 月 29 日，开花期 2016 年 5 月 10 日，膨大期 2016 年 7 月 5 日、果实成熟期 2016 年 10 月 15 日、次年发芽期 2017 年 4 月 1 日.在猕猴桃果实成熟期，在各处理果树上，相同高度、东南西北各方向上取大小一致的熟果 3 个，每棵共计取 12 个，测定果实品质.
1. 4 测定指标及方法
用平板菌落计数法测定土壤中细菌、真菌、酵母菌和放线菌的数量，土壤细菌数量采用牛肉膏蛋白胨培养基测定; 土壤放线菌数量采用高氏 1 号培养基测定，土壤真菌、酵母菌数量采用孟加拉红培养基测定[12].
土壤酶活性测定及表示方法: 蔗糖酶活性测定采用 3，5-二硝基水杨酸比色法，以单位时间内 1 g 风干土催化生成葡萄糖的 mg 数表示; 脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法，以单位时间内 1 g 风干土催化生成 NH3-N 的 mg 数表示; 蛋白酶活性测定采用茚三酮比色法，以单位时间内 1 g 风干土催化产生甘氨酸的 μmol 数表示; 多酚氧化酶活性测定采用焦性没食子酸比色法，以单位时间内 0.3 g 风干土催化生成紫色没食子素的 mg 数表示; 中性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠法，以单位时间内 1 g 风干土催化生成苯酚的 mg 数表示[13].
土壤理化性质测定及方法: 将采集的根际土壤风干后过 100 目筛，按照土壤农化常规分析法[14]，测定其全 P、速效 P、全 K、速效 K、全 N、硝态氮、铵态氮、有机质的含量及 pH.
果实品质测定及方法: 单果质量即为各处理采集的 12 个猕猴桃果实质量的平均值; 果实硬度采用 GY-1 型硬度计测定; 当果实硬度达到 1.0 ～ 1.2 时，果实可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[15]; 可滴定酸测 定 按 照 GB l2293—90 方 法[16]，根 据消耗 的 NaOH 溶液的体积计算可滴定酸的百分含量( 以结晶柠檬酸计) .
1. 5 数据处理
应用 Excel 2003 软件对数据进行处理，用 SPSS 16.0 软件对数据进行单因素方差分析( α= 0.05) ，用 Origin 9.0 软件进行图片绘制.
2 结果与分析
2. 1 不同施肥处理对高龄猕猴桃果园土壤性质的影响
2. 1. 1 高龄猕猴桃果园土壤微生物数量 不同微生物肥料对高龄猕猴桃果园土壤中细菌、真菌和放线菌数量的影响情况见表 1.在猕猴桃不同生长时期微生物数量有较大差异，其中细菌数量在开花期时达到最高，之后下降并趋于平稳; 真菌数量在果实成熟期相对较高，其他几个时期基本平稳; 土壤放线菌数量在发芽期时较其他几个时期低.这些不同生长时期土壤微生物数量的动态变化可能与土壤温度及猕猴桃的生长特点有关.在发芽期施肥后，其他各时期 KF 和 JF 处理组土壤中细菌数量均较 CK 组高，而真菌数量均较低.而 KF 处理组对细菌和真菌数量的影响高于 JF 处理组，在各时期细菌数量最高，真菌数量整体较低.微生物肥料能够促进土壤中放线菌数量的增加.
2. 1. 2 高龄猕猴桃果园土壤酶活性 如图 1 所示，不同处理组的 5 种土壤酶活性在猕猴桃整个生长时期内动态变化过程是一致的，均表现为先升高后降低的趋势，该变化过程可能是由于温度、湿度及猕猴桃生长特点等原因引起的.施肥后猕猴桃整个生长周期内 JF 和 KF 处理的蔗糖酶活性无明显差异，但明显 高 于 CK; JF 组 土 壤 蔗 糖 酶 活 性 较 CK 高 17.9% ～ 83.5%，KF 组土壤蔗糖酶活性较 CK 高 21.9% ～ 76.4%.施肥处理后，不同处理间土壤脲酶活性均在猕猴桃果实膨大期时达到最大值，此时 KF 组和 JF 组土壤脲酶活性均显著高于 CK 组，分别较 CK 高 17.3%和 7.9%; 在其他 3 个时期，JF 和 KF 处理组土壤脲酶活性之间无明显差异，均显著高于 CK 组.在猕猴桃的整个生长周期内不同处理间的土壤磷酸酶活性均表现为: JF>KF>CK，且施肥处理组均显著高于对照传统施肥组; 其中在开花期，JF 和 KF 组的土壤磷酸酶活性分别较 CK 组 高 45. 4%、 37.5%.施肥后不同处理的土壤多酚氧化酶活性均表现为先升高后降低的趋势，在果实成熟期时达到最大; KF 组土壤多酚氧化酶活性在施肥后的整个生长周期内均最高，其中在果实膨大期时显著高于其他 3 个处理; 在果实膨大期和果实成熟期时，KF 组的土壤多酚氧化酶活性分别是 CK 组的 2.05 倍和 2.40 倍.不同处理间土壤蛋白酶活性在生长周期内总体变化趋势基本一致，在猕猴桃开花期时，JF 和 KF 组的土壤蛋白酶活性显著高于 CK 组，分别较 CK 高 16.5%和24.9%，在果实膨大期和成熟期较 CK 组无明显差异.次年发芽期时，微生物肥料处理组 5 种土壤酶活性均显著高于对照.
2. 1. 3 高龄猕猴桃果园土壤理化性质 由表 2 可以看出，在整个生长周期内，微生物肥料处理组土壤全氮均显著高于传统施肥组; 在开花期和果实膨大期， JF 组土壤全氮含量最高，分别较对照高 30. 1% 和 17.0%; 而在果实成熟期和次年发芽期时，KF 组土壤全氮最高，分别为 0.31 和 0.31 g·kg-1 ，显著高于 CK 组.两个微生物肥料组土壤铵态氮在猕猴桃整个生长周期内显著高于对照组，其中 KF 组铵态氮含量较高.在果实膨大期，JF 组土壤全磷显著高于 KF 组，JF 和 KF 分别较对照高 32.9%和 21.5%; 在果实成熟期和次年发芽期，JF 组和 KF 组土壤全磷无明显差异，但显著高于对照.在施肥处理后，各处理之间土壤速效磷含量均表现为: JF>KF>CK; 在果实膨大期时，JF 组土壤速效磷含量达到 213 mg·kg-1 ，较 CK 高 20.9%; 次年发芽期时，JF 组和 KF 组土壤速效磷含量之间无明显差异，但均显著高于对照.施肥后 JF 和 KF 组土壤全钾含量显著高于 CK 组，在开花期时 JF 组和 KF 组土壤全钾含量无显著差异，果实 膨大期时KF组最高，为4.51 g·kg-1 ，果实成熟期时 KF 组最高，为 3.33 g·kg-1 ，次年发芽期时 JF 组最高，为 3.05 g·kg-1 .施肥后的整个生长周期内，各组间土壤速效钾含量变化均表现为: KF>JF>CK，其中 KF 组 土 壤 速 效 钾 含 量 较 CK 组 高 6. 3% ～ 33.3%.
2. 1. 4 土壤酶活性与土壤理化性质之间的关系 对测定的 11 项土壤酶与土壤养分指标之间的相关性进行分析( 表 3) ，结果表明，土壤蔗糖酶、蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶活性与除全氮外的其他各项指标间均存在极显著或显著相关性; 土壤磷酸酶活性和速效磷含量与除全氮外的其他各项指标间均存在极显著相关性; 速效钾含量与除全氮和全磷之外的其他各项指标间存在极显著相关性; 铵态氮与除全磷、全氮、全钾外的各项指标均存在极显著或显著相关性; 全钾含量与除全氮、有机质、铵态氮外的其他各项指标间均存在极显著或显著相关性; 全磷含量与除全氮、速效钾、铵态氮之外的其他各项指标间存在极显著或显著相关性; 全氮含量与其他 10 项指标均不存在显著相关性.
2. 1. 5 高龄猕猴桃果园土壤有机质和 pH 由图 2 可以看出，在猕猴桃的整个生长周期内，CK 组土壤 pH 几乎没有变化，但 JF 和 KF 组土壤 pH 均明显下降，且在果实成熟期时达到显著水平.其中在果实成熟期时，JF 和 KF 组土壤 pH 分别较对照降低了 0.29 和 0.34 个单位; 而在次年发芽期时分别较对照降低了 0.30 和 0.34 个单位.在施肥处理后的整个猕猴桃生长周期内，微生物肥料处理组的土壤有机质含量均显著高于对照组; 在果实膨大期时，JF和KF组土壤有机质含量分别较 CK 高 11.0%和 10.2%.次年发芽期时，微生物肥料处理组土壤有机质含量较前年发芽期时升高.
2. 2 不同施肥处理对高龄猕猴桃果实品质的影响
不同施肥处理对猕猴桃果实品质的影响如表 4 所示，JF 和 KF 组果实硬度显著高于 CK，分别较 CK 高 26.8%和 24.1%.果实可溶性糖和维生素 C 含量变化均表现为: KF>JF>CK，且 JF 和 KF 组显著高于对照; KF 和 JF 组的维生素 C 含量分别是 CK 的1.59 和 1.58 倍.微生物肥料组猕猴桃果实可滴定酸含量低于对照且均达到显著水平，其中 JF 和 KF 组分别较 CK 降低了 5.2%和 6.1%.KF 组的猕猴桃单果质量最高，为 184 g，较 CK 高 18.7%，JF 组果实单果质量也显著高于对照.
3 讨 论
解磷细菌和枯草芽孢杆菌均属于植物促生菌，能够明显促进植物生长，这已为大量研究所证实[17-20].其主要机制是枯草芽孢杆菌和解磷细菌能促使猕猴桃幼苗叶绿素含量升高，光合速率增强，表现为植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量显著增加，体内碳代谢旺盛进而促进植株快速生长[10，21-22].
根际微生态系统是植物-土壤-微生物及其环境相互作用的特殊系统[23]，该生态系统中根际微生物群落结构的变化能够直接影响土壤物质循环、能量流动、信息传递，进而影响植物生长发育过程[24].试验证明，生物菌肥能够增加玉米、青梗花椰菜根际土壤细菌和放线菌数量，减少真菌数量[25-26]; 本文试验结果( 表 1) 也再次证实，施加微生物肥料 JF 和 KF 能显著提高土壤细菌和放线菌数量，降低土壤真菌数量，这很可能是因为这两种微生物肥料能在土壤生态系统中与原土著有益菌形成优势菌群，降解有机物，改变土壤结构，抑制有害病菌生长[27].
土壤酶是由微生物、动植物活体分泌物或动植物残体、遗骸分解释放于土壤中的一类具有催化能力的生物活性物质，其活性是土壤重要的肥力指标[28].微生物菌剂的施用能显著提高土壤关键酶活性，主要因为微生物菌剂能加速有机化合物分解，为土壤酶提供了足量的底物[29].土壤蔗糖酶反映土壤或基质中的碳元素转化; 磷酸酶能促进有机磷化合物或无机磷酸盐的转化[29]; 土壤脲酶是能够催化酰胺化合物水解为氨的一种水解酶[30]; 土壤多酚氧化酶能促进土壤中的多酚化合物氧化成相应的醌类化合物[31]; 土壤蛋白酶主要介导土壤中蛋白质的分解[32]，它们均与土壤养分代谢密切相关. 张 美 存等[33]研究了微生物菌剂对草坪植物高羊茅土壤酶活性的影响，结果显示，土壤中蔗糖酶、脲酶、多酚氧化酶活性显著提高; 孙家骏等[34]研究表明，有机肥配施微生物菌剂后，提高了猕猴桃土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶活性; 闫瑞瑞等[35]研究表明，微生物肥料能够提高呼伦贝尔打孔羊草草甸草原土壤脲酶和蔗糖酶活性; 本试验施加微生物肥料 JF 和 KF 后，在猕猴桃整个生长周期内土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶活性也均高于对照，这与上述研究者的研究结果基本一致.本文研究结果还显示，施用微生物肥料组土壤蛋白酶活性在开花期时显著高于对照，之后则与对照无明显差异.这可能是猕猴桃在开花期需要大量的氮素所致，也可能与土壤种类或猕猴桃植株代谢的特性有关，尚需进一步研究.
施用生物菌肥可将土壤中难溶性养分转化为可溶性养分，进而达到培肥地力的效果[36-38].本研究相关性分析结果表明，施用两种微生物肥料的土壤全磷、全钾、速效磷、速效钾、铵态氮含量均与 5 种土壤酶活性间存在极显著或显著相关性，说明土壤养分含量的提高主要依赖于土壤酶活性的增强，这与 Zantua 等[39]的研究结果一致.土壤全氮与土壤酶之间之所以没有显著相关性，这很可能是由于施用微生物肥料后土壤中有机质含量大幅度提高，而土壤有机质是影响土壤全氮的重要因素[40]，因此土壤有机质对土壤全氮含量的影响大于土壤酶对其造成的影响.另外，由于微生物肥料中含有大量有益菌和丰富的有机质，施入后能够提高土壤有机质和土壤微生物数量.土壤微生物是活着的有机体和物质转化作用者[41]，参与土壤中碳、氮、磷等元素循环过程，土壤微生物数量提高加快了土壤元素循环，进而促进土壤全氮、全磷含量提高.猕猴桃生长的最适宜土壤 pH 是 5.5 ～ 6.5，而陕西眉县猕猴桃果园土壤 pH 偏高( 7. 7 ～ 7. 9) ，不利于猕猴桃树体生长; 本研究中，施用两种微生物肥料后的一年内土壤 pH 下降 0.29 ～ 0. 34 个单位，这与罗玉兰等[42] 的研究结果一致.
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微生物肥料通过改善植物根系土壤微生物结构，提高土壤酶活性，增加土壤有效养分含量，进而促进植物生长，提高产量并改善品质.不同微生物菌剂能够显著提高番茄植株生长量、果实产量和维生素 C 含量[43]; 促进黄瓜营养生长，显著提高产量和果实中可溶性糖、维生素 C 含量等[44].本研究结果也表明，微生物肥料 JF 和 KF 能够显著提高猕猴桃单果质量、硬度、维生素 C 和可溶性糖含量，降低其可滴定酸含量，明显提高猕猴桃果实品质.
4 结 论
施用微生物肥料 JF 和 KF 能够改善和平衡土壤微生物结构，调节土壤酶活性，提高土壤肥力和养分利用率，进而提高并较好保持猕猴桃果实品质.相对于化学肥料而言，微生物肥料能够促进农业生态环境保护以及高产、优质、高效农业的持续发展，广泛使用微生物肥料将引领生态农业新潮流，而该研究结果可为合理利用微生物肥料改良猕猴桃土壤和提高猕猴桃果实品质提供理论依据.——论文作者：库永丽1 徐国益1 赵 骅2 董天旺1 曹翠玲1*
参考文献
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