摘要：三相分离(TPP)是将硫酸铵与叔丁醇混合后形成有机相、中间沉淀相和水相。在20。C，调节发酵上清波的pH至6.o，加入硫酸铵使终浓度为400 g/L，溶解后加入与上清液等体积的叔丁醇，静置1 h分相，胆固醇氧化酶在有机相和水相之间形成蛋白沉淀，12 ooo r/min离心10 min 收集中间蛋白相，用pH 7.5，10 mmol/L的磷酸缓冲液溶解。结果表明;利用三相分离技术从乳化体系中分离纯化胆固醇氧化酶，比酶活提高了3.49倍，收率迭93%。回收的酶液进一步经过 DEAE—Sepharose Fast Flow纯化，比酶活从3.56 U/mg提高到30.15 U/mg。该酶最适反应温度为60。C，最适反应pH为7.5，酶的等电点为8.5，该酶在37。C，pH 6.o～8.o较为稳定。H92+和 Ag+离子完全抑制胆固醇氧化酶的活性。
关键词：甾短杆菌;胆固醇氧化酶;分离纯化;三相分离;酶学性质
胆固醇氧化酶(ECl.1.3.6，COD)是依赖辅酶 FAD，能专一性地催化胆固醇转化为胆甾一4一烯一3一酮‘¨，在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有广泛应用价值。产胆固醇氧化酶的微生物有多种，如节杆菌、马红球菌、诺卡氏菌、假单胞菌、链霉菌，不同来源的胆固醇氧化酶的生理特性及底物特异性不同[2]。本实验室从土壤中筛选得到一株胆固醇氧化酶生产菌B卯口i施c￡eri“m sp.DGCDC82[3‘。
胆固醇和酵母膏是生产胆固醇氧化酶的最佳碳源和氮源[4]。因此胆固醇在培养基中的分散效果是影响产酶的重要因素。利用表面活性剂乳化胆固醇对产酶有重要作用D]。本实验室利用表面活性剂 Tween一80、异丙醇和橄榄油乳化胆固醇对产酶有显著作用印]。这主要是因为提高了胆固醇在培养基中乳化稳定性促进了它的分散效果，从而促进了它对 B化口i施f￡P一“优sp.DGCDC-82产酶的诱导效果。
在胆固醇氧化酶的提取过程中，硫酸铵盐析是最常见的方法[7~8]。但是在作者的实验过程中，由于残留的胆固醇、Tween-80和橄榄油形成稳定的混合物，而且与胆固醇氧化酶亲合在一起，因此利用硫酸铵盐析无法有效地将胆固醇氧化酶从乳化体系中分离出来。
三相分离(TPP)是一个简单的技术，盐和有机溶剂添加到发酵上清液中[9]。一个小时后三相形成。上相是有机相(包含非极性化合物)，下相是水相(包含极性化合物)，中间层为蛋白质沉淀。作者利用三相分离技术分离胆固醇氧化酶，胆固醇、 Tween一80、橄榄油及色素富集在上相，而酶蛋白浓缩在中间相。这样既有效地破除了乳化体系又可以达到浓缩纯化的效果。虽然成本比硫酸铵盐析略高，但是纯化倍数和收率都比较高。
本文报道了用三相分离和离子交换技术从乳化体系中分离纯化胆固醇氧化酶，并对纯酶的酶学性质进行了研究。
1实验材料和方法
1.1材料
1.1.1 茵种 BrP口i6口f￡Pri“，扎 sp.CCTCC M201008，由本实验室保藏。
1.1.2培养基种子培养基(g/L)：牛肉浸膏3，蛋白胨10，NaCl 5。发酵培养基(L)：胆固醇4 g，酵母膏8.5 g，NaCl 1 g，CH3C00NH4 4 g，K2HP04 O.2 g，MgSQ 0.05 g，FeSOl O.01 g，CaCl2 0.1 mL，Tween-80 3 mL。以上培养基pH调至7.5左右，然后于O.1 MPa下灭菌15 min。
1.1.3 主要生化试剂 DEAE—Sepharose Fast F10w(Pharmacia公司);牛血清蛋白、SDS、丙烯酰胺、N，N，_2亚甲基双丙烯酰胺，分析纯，分子量标准蛋白、等电点标准蛋白均购自Sigma公司;其他生化试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1 培养条件 斜面活化48 h，种子在37。C， 220 r/min振荡培养14～16 h。发酵条件：500 mL 三角瓶装液量为100 mL，接种量5%，温度37。C， 220 r/min。
1.2.2胆固醇氧化酶活力的测定 原理：胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)的催化下分解成一分子的胆甾一4一烯一3一酮和一分子的H。O。，H：Oz在过氧化物酶的作用下分解，可使4一氨基一安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，它在500 nm处有最大吸收峰，通过测量反应液在500 nm处的吸光值，可定量测定胆固醇的氧化量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位口]。
操作方法[31：3 mL溶液A(4一氨基一安替比林1 mmol/L，苯酚6 mmol/L，叠氮钠o.2 g/L，过氧化物酶5 ooO U/L，磷酸钾缓冲液25 mmol/L pH 7.5)，150“L溶液B(胆固醇8.26 mg/mL，Triton X一100 9=o.042 6，异丙醇为溶剂)，50弘L酶液， 37。C反应5 min，沸水浴3 min，于500 nm测吸光度。酶活(U/mL)=1.683 2×A500。
1.2.3蛋白质浓度的测定 按Lowry法[10]测定，以牛血清白蛋白作标准。
1.2.4 酶的分离与纯化 (1)不同种类有机溶剂三相分离效果的比较：室温条件下，在30 mL发酵上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度达到300 g/ L，将等体积的有机溶液加入上述溶液中，静置分相，12 ooo r/min离心10 min，收集中间相，用10 mL pH 7.5的50 mmol/L的磷酸缓冲液溶解后按照标准方法测定酶活和蛋白质浓度。(2)温度和时间对三相分离效果的影响：改变提取温度，以上述相同方法收集中间相测定酶活和蛋白质浓度。(3)pH 对三相分离效果的影响：改变pH，其他条件不变，以上述相同方法收集中间相测定酶活和蛋白质浓度。(4)硫酸铵浓度对三相分离效果的影响：20 oC， pH 6.o的条件下，在30 mL发酵上清液中加入不同浓度的硫酸铵，其他条件和操作方法同上，收集中间相测定酶活和蛋白质浓度。(5)叔丁醇浓度对三相分离效果的影响：20。C，pH 6.o的条件下，在30mL发酵上清液中加入硫酸铵、使终浓度为400 g/ L，将叔丁醇以不同的比率加入到发酵上清液中，以上述相同方法收集中间相测定酶活和蛋白质浓度。 (6)离子交换柱操作条件：经三相分离处理，并将透析后的酶液加到已用pH 8.0的10 mmol/L Tris缓冲溶液平衡的离子交换层析柱(2.o cm×40 cm)，先用pH 8.O的Tris缓冲溶液洗柱，再用线性梯度的缓冲液梯度洗脱。平衡和进样流速为2 mL/min;洗脱流速为3 mL/min;每管收集6 mL，将活性部分收集.
1.2.5酶学性质 (1)最适反应温度及热稳定性：在不同温度下按照标准方法测定酶活，以酶活最高者为100%;酶液分别在65、60、55、50、45、37。C下保温15 min，迅速冷却至室温，按标准方法，测残余酶相对活力，以未保温的酶液的酶活为100%。 (2)酶的最适反应pH及pH稳定性：将酶液分别加在pH 5.5～8.5的o.1 mol/L的磷酸缓冲液中，按标准方法测酶活力，以酶活最高者为100%;将酶液用pH 5.5～10.O的缓冲液稀释，25。C保温20 h 后，测残余酶活力，以未保温的酶液的酶活力 100%。(3)等电点测定：凝胶的浓度75 g/L，载体两性电解质的pH为3.5～10.O，蛋白质染色用o.5 g/L考马斯亮蓝R-250溶液[1¨。(4)金属离子对酶活力影响：用10 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.O)配成含2 mmol/L不同金属离子的缓冲液，与一定量酶液在25。C保温1 h后，测定胆固醇氧化酶活力。以不含金属离子反应液为对照。
2实验结果与讨论
2.1 三相分离条件的优化
三相分离是一个简单而且易于放大的预处理粗酶液的方法，而且不象硫酸铵盐析那样在下一步的离子交换之前必须透析脱盐，三相分离常常可以省略透析脱盐[12。。影响三相分离效果的因素很多，包括酶蛋白的特性、酶蛋白浓度、pH、离子强度、提取温度、有机溶剂类型以及处理时间等。因此有必要研究这些因素对三相分离效果的影响，并对三相分离条件进行优化。
2.1.1 不同有机溶剂对三相分离的影响 由表1 可知三相分离纯化胆固醇氧化酶时使用叔丁醇作溶剂的收率和比酶活都是最高的，这与Sharma报道的一致[1 3。。这可能是因为叔丁醇的分子大小和分枝结构，使其不容易渗透进入到酶蛋白的折叠结构内部。因此不容易引起酶蛋白变性失活[1引。虽然很多关于三相分离的报道中都是利用叔丁醇作为有机溶剂，但是也有报道利用其他有机溶剂如四氢呋喃等进行三相分离取得较好的结果m1。
2.1.2 不同提取温度和时间对TPP效果的影响三相分离的温度和时间是两个重要的物理参数。由于这两个参数理论上与其他的物理参数如盐离子强度、pH和溶剂浓度相比，对三相分离效果的影响较小，所以作者对这两个因素先进行了确定。提取时间和提取温度对三相分离效果的影响如图1。由图可知，较低的温度传质速率较低，三相形成时间较长，增加了酶蛋白与有机溶剂接触的机会，引起酶蛋白变性。但温度太高容易使酶变性失活。从图1中可以看出延长提取时间(即100 min)在较高温度时 (即30。C)收率明显下降。基于以上研究结果，最适的提取时间和提取温度为20。C，60 min。
2.1.3 pH对三相分离效果的影响 在三相分离操作前首先要调节发酵上清液的pH，因为三相分离与传统的硫酸铵盐析不同，传统的硫酸铵盐析时，远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH常选在该蛋白质的等电点附近。但是三相分离在等电点附近时硫酸盐的阴离子与阳离子的酶蛋白的静电相互作用发生急剧下降，所以三相分离效果受到明显的影响[1引。可以利用这一特性，先调节pH和硫酸铵浓度沉淀杂蛋白，再调节pH和硫酸铵浓度沉淀目的蛋白，达到分级沉淀的目的。从图2可以看出，pH 6.o时收率和比酶活都比较高，因此，三相分离操作前pH应调节到6.0左右。
2.1.4硫酸铵浓度对三相分离效果的影响 硫酸铵不但具有较强的亲水性，而且由于Hofmeister效应，对酶蛋白结构具有稳定作用m]。一般情况下，叔丁醇和水是完全互溶的。但是当加入足够的硫酸铵后，就会分为两相，上相叔丁醇相和下相水相。如果最初的溶液中含有酶蛋白，则随着硫酸铵浓度的增加中间的酶蛋白相将逐渐形成。这是利用三相分离技术分离纯化蛋白的基础。由图3可以看出，当硫酸铵浓度为400 g/L时比酶活最高，且收率达 92%。
2.1-5叔丁醇浓度对三相分离效果的影响 虽然硫酸根是一个二价的阴离子而叔丁醇是中性分子，但是在三相分离体系中，它们能够相互加强彼此的物化作用口引。从图4中可以看出，上清液与叔丁醇体积比为1：1时，收率和比酶活最高。增加叔丁醇浓度，收率和比酶活都会下降，这可能是因为较高浓度有机溶剂容易引起酶蛋白失活。
相关知识推荐：2021年发表过的三相分离相关论文
由以上的实验结果可知最优的三相分离条件为：20。C，调节发酵上清液pH到6.O，加入的硫酸铵使硫酸铵终浓度为400 g/L，溶解后加入与上清液等体积的的叔丁醇，静置1 h分相，12 ooo r/min 离心10 min收集中间蛋白相，用pH 7.5，10 mmol/ L的磷酸缓冲液溶解，在此条件下收率和比酶活分别为93%和3.56 U/mg。
2.2离子交换色谱
将经过三相分离处理后的发酵上清液进一步用 DEAE离子交换柱纯化，如图5。将发酵上清液， TPP处理后的酶液和DEAE纯化后的酶蛋白经 SDs_PAGE检测，结果显示TPP不但可以破除乳化体系，同时还具有部分纯化的作用;样品经DEAE 进一步纯化后，酶蛋白达到电泳纯。如图6所示。整个纯化结果如表2所示。
2.3胆固醇氧化酶部分酶学性质
2.3.1 最适反应温度及热稳定性 实验结果表明，酶在37。C保温15 min残留98%的活力，高于 65。C时酶活力，说明该酶对高温敏感，酶的最适反应温度为60 oC。
2.3.2 最适反应pH及pH稳定性 由实验结果可知，该酶在pH 6.O～8.O比较稳定;该酶的最适反应pH为7.5。
2.3.3等电点测定 经等电聚焦电泳测定胆固醇氧化酶的等电点为8.5(室温)。
2.3.4金属离子对胆固醇氧化酶活性的影响 结果见表3。多种金属阳离子对该酶都有不同的影响，其中H92+和Ag+离子具有显著抑制胆固醇氧化酶活性的作用。
3 结论
用三相分离从乳化发酵液中分离纯化胆固醇氧化酶，优化后的三相分离条件为：在20。C，调节发酵上清液的pH至6.o，加入硫酸铵使终浓度为400 g/L，溶解后加入与上清液等体积的叔丁醇，静置 1 h分相，12 ooO r/min离心10 min，收集中间蛋白相，用pH 7.5，10 mmol/L的磷酸缓冲液溶解。经三相分离纯化后，胆固醇氧化酶的比酶活提高了 3.49倍，收率达93%。回收的酶液进一步经过 DEAEISepharose Fast Fow纯化，比酶活从3.56 U/mg提高到30.15 U/mg，收率为64%。对纯酶的酶学性质研究结果表明：该酶最适反应温度为 60。C，最适反应pH为7.5，酶的等电点为8.5，该酶在37℃，pH 6.o～8.o较为稳定。H92+和Ag+ 离子完全抑制胆固醇氧化酶活性。——论文作者：王龙刚， 梁爽， 王武
参考文献：
[1]吕陈峰，陈毅力，王龙刚，等.利用胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾一4一烯一3一酮[J].无锡轻工大学学报。200l，20(5)： 485—488.
[2]MacLachlan J，wothersp00n A T，Allsell R o，以“.Cholesteml o】【idase：S0urces，physical properti盼and analytical applications [刀.J Steroid Biochem Md Bi01，2000，72：169—195.
[3] 王龙刚，吕陈峰，王 武.Brevibacterium sp.DGCDD82发酵罐中生产胆固醇氧化酶[刀.无锡轻工大学学报，2003，22 (2)：35—37.
[4]LeeMT，Chellwc，choucC Nutritional触orstht affect the production of cholester01 o五dase by R^odwocc郴∞“no.23 口].Biotechnol Appl Bioch锄，1997，26：159一162.
[5] Buckland B C。LilIy M D，Dunnill P.The kinetics of choles— ter01 o)【idase synthesis by Nocnrd谊砌odoc^roⅣ5[J]. Bio— techn01 Bioeng，1976，18：60卜621.
[6] Ln c F，wang w，Tang Y x，ef口f.Effect of cholesteroI bio— availability.improving factors on choIesterol oxidase produc— tion by a mutant Bre可i6ncfP一“m sp.DGcDc-82[J].Process Biochem，2002，37：90l一907.
[7] Lartillot s，Kedziora P. Production，puri“cation and some properties of cholesterol o】【idase from a StMp￡o聊yces sp.[J]. Prep Biochem，1990，20：5l一62.
[8] Machang R s，Pfescott J F. Purification and properties of cholesterol oxidase and choline phosphohydr01ase fmm R^odD∞ff“s￡口“[J].Can J Vet Res，199l。55：332—340.
[9] Roy I，shama A，Nath M，甜口z.Recovery of bioIo舒caI activity ill reversibly inactivated proteins by three phase parti— tioning[J]. E眦yme&Micmbial Technology，2005，37： 113一120.
