摘 要：为了缓解煤炭开采对神东矿区农业生产和地表环境造成的破坏，试验模拟神东矿区干旱缺水特点，以煤炭开采塌陷区退化土壤为供试基质，玉米为供试植物，研究丛枝菌根真菌(每克干土中含 63 个孢子)和不同浓度的外源钙(5，10，20，40，80 mmol/L)协同效应对中度干旱胁迫下苗期玉米生长的影响。结果表明，干旱胁迫下，20 mmol/L 外源钙与丛枝菌根真菌协同效应最优，玉米质量平均每株可达 4.03 g，组织含水率和叶色值分别达到 91.68%和 43.67，玉米植株内氮磷钾累积量显著高于其他处理;同时，玉米根际土壤球囊霉素相关蛋白增加最为明显，总球囊霉素和易提取球囊霉素分别达到 4.3 和 1.6 mg/g，根际土壤中有机质含量增加明显。丛枝菌根真菌与外源钙联合作用有利于玉米的生长，缓解了干旱胁迫对苗期玉米生长的影响，接种丛枝菌根真菌对矿区退化土壤具有显著改良效应。
关键词：干旱，钙，土壤，丛枝菌根，神东矿区，玉米，球囊霉素
0 引 言
神东矿区是中国已探明储量最大的煤田，为世界七大煤田之一，产量居全国之首，其沉陷面积大[1]。神东矿区属典型的半干旱、半沙漠的高原大陆性气候，区内不少地区气候干燥，降水稀少而集中，光照充足，蒸发强烈，空气干燥，极不利于植物的生长，矿区生态环境脆弱且易受破坏。煤炭开采对土壤质地和地表植被的破坏严重，井工开采导致地面塌陷，地面塌陷过程中会产生大量裂缝，导致地表水分和养分流失，同时塌陷过程中产生的拉力对植物根系损伤严重[2]。钙元素是植物细胞膜重要组成成分，也是植物受到外界环境胁迫和激素调节的重要信号分子，对细胞内矿质养分和有机化合物具有重要的调节作用[3-5]。干旱条件下，钙离子参与干旱信号脱落酸(abscisic acid)的传递，调节干旱胁迫导致的气孔关闭，诱导胁迫应答基因表达，增强植物对逆境的耐受能力[6]。钙离子通过对质膜水通道蛋白磷酸化的修饰作用，调节植物根细胞在渗透胁迫下的吸水活性[7]。同时，钙离子还可以改善土壤的理化性质和增加土壤的团聚作用[8]。通过前期研究发现，对于干旱缺水的矿区退化土壤来说，施加一定的外源钙可以缓解逆境胁迫对植物生长的影响。
丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一种普遍存在的内共生真菌，它能够与 80% 以上的陆生植物形成共生体[9]。随着研究的不断深入，AMF 的作用越来越广泛，AMF 在植物群落结构、演替和稳定性方面具有重要的生态学意义[10-12]。AMF 能提高植物对氮、磷、钾等营养元素的吸收，还可缓解盐碱化对植物生长的影响[13-16]。AMF 也可降低其他生物对宿主植物的伤害，提高植物的抗旱性和增加植物的生物量[17-18]。干旱条件下 AMF 能够提高宿主的耐受性，有利于宿主植物对水分的吸收[19-20]。 AMF 产生的土壤相关蛋白是土壤的一个重要碳库，其可以增强土壤团聚体的稳定性，改善土壤质量。利用 AMF 在神东矿区塌陷区土地复垦发现，AMF 能够促进植物吸收矿质养分和水分，提高作物抗逆性和抗病性，改良土壤结构，增强土壤肥力，提高苗木移栽成活率，促进植被恢复[21-23]。
本研究主要模拟神东矿区干旱缺水特点，以西北地区常见农作物玉米为宿主，以矿区退化土壤为基质。研究不同浓度外源 Ca2+和 AMF 协同作用对苗期玉米在矿区退化土壤上生长的影响，以及对玉米矿质养分的调节效应，同时研究 AMF 对矿区退化土壤的改良效果，为 AMF 应用于西部干旱矿区农业生产提供一定的理论基础，也为钙肥在矿区破坏土地上提高农作物抗旱性性能提供理论依据，同时为后期矿区抗旱保水剂与 AMF 菌剂的联合开发提供技术支撑。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试土壤于 2011 年 4 月采自陕西省神木县李家畔镇活鸡兔矿塌陷区，为沙质退化矿区土，风干，过 1 mm 筛。供试土壤基本性状为 pH 值 7.48;电导率 35.4 μS/cm，最大持水量为 22.86%;有机质 6.07 g/kg;总氮为 0.34 g/kg;全磷 0.41 g/kg;有效磷为 7.2 g/kg;速效钾 50 g/kg;供试玉米种子由中国农业科学院种子公司提供，玉米品种为农大 CFO24。供试菌种为北京市农林科学院植物营养与资源研究所微生物室提供经本实验室增殖培养的内生菌 Glomus mosseae(简称 G..m)。
1.2 试验方法
试验于 2011 年 8 月在中国矿业大学(北京)温室内进行，试验分别设干旱加丛枝菌根组(CK+M)、干旱不加丛枝菌根组(CK)、正常供水组(NI)和正常供水加菌组(NI+M)，干旱胁迫组浇水量为土壤最大持水量的 55%，正常供水组浇水量为土壤最大饱和持水量，同时设 5 加钙组和 5 加钙加菌组，试验分别用不同 CaCl2 浓度处理(浓度为 5，10，20，40，80 mmol/L)，分别在出苗 1、 5 和 10 d 浇灌 CaCl2 溶液，每次浇灌 100 mL。栽种玉米的塑料盆规格为：11 cm(高)×13 cm(盆口直径)×9 cm(盆底直径)，每盆加矿区土量为 1 400 g，AMF 接种量按每 1 kg 灭菌后的风干矿区退化沙土加 50 g 的菌剂充分混合。种植玉米前向矿区退化土壤加入 NH4NO3，KH2PO4，K2SO4 配置营养液作为底肥，使供试土壤中 N、P、K 质量分数分别为 100，10，150 mg/kg，每个处理 3 个重复，浇水达到最大饱和持水量，水分平衡 1d 后，播种。将玉米种子用 10% H2O2 溶液浸泡 10 min 做表面消毒，在用去离子水清洗 10 次，每个小盆播种玉米 5 棵，玉米出苗 4 d 后间苗，每盆保持 2 株，模拟矿区干旱胁迫，浇水量为土壤最大持水量的(55±5)% (中度干旱)[24]。利用称重法控制浇水量，使每盆土壤的含水率维持在中度干旱水平。
1.3 测定项目和方法
1)玉米生长指标测定
苗期玉米生长到 45 d 后，分别采集干旱胁迫的玉米，用自来水清洗根系附着的泥土，同时将植物地上部分和根系分开，在 100℃烘箱内杀青 30 min，然后放到 70℃烘箱内直至烘干。分别称量每盆玉米的地上部分和根系的干质量。
2)叶片相对含水率和叶片 SPAD 值
叶片相对含水率(RWC%)=(Wf−Wd)/(Wt−Wd)× 100，Wf 为叶片鲜质量，g;Wd 为叶片干质量，g; Wt 为叶片被水充分饱和后的质量，g。苗期玉米叶片 SPAD 值(叶色值)采用 SPAD-502(浙江托普生产)测定。
3)玉米 TN、TP、K 和 Ca 的测定
玉米叶片和根系中全氮和全磷含量的测定参考鲍士旦[25]的方法。植物矿质元素离子含量测定，将植物的地上部分和根部的分开，将烘干样品烘干粉碎后，精确称量 0.5000 g，用 HNO3消煮，定容于 50 mL，用 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，电子感耦合等离子体发射光谱仪，德国斯派克生产)测定 K +、Ca2+含量。
4)侵染率、菌丝密度和根际土有机质测定方法
玉米收获时，拣出较细的玉米根系，用水清洗干净，剪成 1 cm 长根段，混匀后取鲜根测定菌根侵染率[26]。菌丝密度采用网格交叉法测定[26]。选择紧贴玉米根系土壤，过筛测定土壤有机质，土壤有机质含量的测定采用重铬酸钾外加热法(K2Cr2O7- H2SO4法)。
5)球囊霉素提取和测定方法
球囊霉素是由丛枝菌根真菌分泌的一种含金属离子的糖蛋白，因被非专一性提取而称为球囊霉素相关土壤蛋白(GRSP)，通常定义为 Bradford反映土壤蛋白，由土壤样中提取出来，分为易提取球囊霉素(easily extractable glomalin，EEG)和总球囊霉素(total glomalin，TG)，按照 Wright 及 Janos 的方法稍加修改[28-29]。
球囊霉素相关土壤蛋白的提取：易提取球囊霉素相关土壤蛋白的提取方法为：分别称取土样1.00 g 于带刻度离心管中，对应加入 8 mL 柠檬酸钠浸提剂(20 mmol/L、pH 值 7.0)，加盖，摇匀，在 103 kPa、121℃下提取 30 min，10 000×g 下离心 6 min，收集上清液，每个处理重复 4 次。总球囊霉素相关土壤蛋白的提取：分别秤取土样 1.00 g 于带刻度离心管中，对应加入 8 mL 柠檬酸钠浸提剂(50 mmol/L、pH 值 8.0)，加盖，摇匀，在 103 kPa、 121℃下提取 60 min，再重复提取 5 次，每次重复提取时，保证提取液体积固定且摇匀土样，使土样与浸提剂充分接触 ;每提取一次之后迅速在 10 000×g 下离心 6 min，将上浮物从土壤中分离出去，收集上清液，每个处理重复 4 次。上清液储藏在 4℃下直至第 2 天分析。
球囊霉素相关蛋白的测定：分别吸取 0.5 mL 的上清液，加入 5 mL 考马斯亮蓝 G-250 染色剂(使用之前过滤)，加盖，震荡，显色 10 min，于 595 nm 波长下比色。用牛血清白蛋白(BSA)作标准液，考马斯亮蓝法显色，绘制标准曲线，以 1.00 g 土壤中蛋白质的微克数表示球囊霉素相关土壤蛋白的含量。
1.4 数据分析
本研究采用 SAS 统计软件对试验数据进行分析，显著水平设置为 5%。
2 结果与分析
2.1 AMF 与外源钙协同效应对玉米生长的影响
干旱胁迫条件下，接种 AMF 能显著促进玉米的生长，接入 AMF 组玉米生长明显要好于不加 AMF 组，同时在退化矿区土壤上施加一定浓度的外源钙会促进玉米生长。由表 1 可见，干旱胁迫条件，当施入外源 Ca 2+ <20 mmol/L 时，加菌组和不加菌组的玉米生物量、叶片相对含水率和叶色值都随着外源钙的浓度增加而增加，当 Ca 2+ >20 mmol/L 时，玉米的各项指标随着外源钙浓度增加而减少，这可能高浓度的钙离子使退化土壤盐碱化，破坏了玉米根际的离子平衡，抑制了玉米的生长。当 AMF 和不同浓度外源钙联合处理时，明显促进了玉米的生长，玉米的干质量、相对含水率和叶色值要好于单一的加钙处理或加菌处理，施入外源钙浓度为 20 mmol/L 时，玉米的生物量和叶色值达到最大值，且和其他处理组相比，差异性达到显著水平(P<0.05)，但和正常供水加菌组无明显差异(P>0.05)。研究发现，所有接菌组的根冠比都要小于不加菌组，在干旱胁迫下，光合产物优先分配给根系，使根冠质量比(R/S)加大，而接入 AMF 缓解了干旱对苗期玉米根系的影响，明显降低了 R/S 值，接种 AMF 缓解了干旱胁迫对玉米的影响，有利于苗期玉米生长。
2.2 AMF 与外源钙协同效应对玉米矿质养分的调节
对于退化的塌陷区土壤来说，接种 AMF 和添加适当浓度的外源钙可以提高玉米对矿质养分的吸收(表 2)，同时可以提高玉米的抗旱能力。无论干旱条件还是正常供水，接种菌根都能显著提高了玉米对氮、磷、钾和钙的吸收，玉米地上部分氮、磷和钾元素累积量要高于根系部分，而钙在植物体内不易运输，根系钙的累积量要高于地上部分。研究发现，不管接种 AMF 与否，一定浓度的外源钙明显促进矿区玉米生长，向退化土壤施加外源钙浓度小于 20 mmol/L 时，玉米地上部分和根系部分氮磷钾的累积量随着外源钙的浓度增加而增加，外源钙浓度大于 20 mmol/L 时，玉米地上部分和根系部分氮磷钾的累积量随着外源钙的浓度增加而减少，但玉米钙元素累积量随着外源钙的增加而增加。干旱条件下，Ca(20)+M 组玉米对养分吸收最优，平均每株玉米地上部分氮磷钾钙累积量分别达到 39.2、 4.27.、126.28 和 86.7 mg，根系部分氮磷钾钙的累积量也达到 10.13、1.76、17.15 和 50.44 mg，和其他处理组相比达到显著性水平(P<0.05)，但其地上部分氮磷含量要低于正常供水加菌组，根系部分氮磷积累量要高于正常供水加菌组。Ca(20)+M 组对钾元素的吸收要略强于正常供水加菌组，差异性不显著，但和其他处理组相比有显著性差异。玉米地上部分和根系部分的钙浓度都随着外源钙浓度增加而增加，外源钙浓度为 80 mmol/L 时，玉米体内钙含量最高，玉米生长状况最差，高浓度的外源钙不利于玉米生长，往往会形成盐害，抑制了玉米的生长。
2.3 AMF 与外源钙协同效应对矿区退化土壤的改良效应
干旱胁迫条件下，对于退化的矿区土壤，AMF 与外源钙协同效应对矿区退化土壤具有显著改良效应(表 3)。在施加外源钙浓度为 20 mmol/L， AMF 对苗期玉米生长的正效应为最大，玉米根系侵染率和菌丝密度分别可达到 86.67%和 4.33 m/g，但和对照加菌组差异性并不显著(P>0.05)，这可能是逆境条件更有利于增强 AMF 对宿主植物的作用效果。研究发现，高浓度的外源钙不利于 AMF 对玉米的侵染，相反还会抑制苗期玉米的生长，可能是高浓度的钙破坏了玉米根系和矿区退化土壤间的离子平衡，不利于玉米对土壤水分和养分的吸收。干旱条件下，无论正常供水还是向土壤中施加不同浓度的外源钙，不加 AMF 组玉米根际球囊霉素相关蛋白和根际土壤有机质含量没有明显变化，统计分析发现，不加 AMF 组间总球囊霉素、易提取球囊霉素和有机质没有显著的差异性(P>0.05)。加入 AMF 能显著提高根际土壤总球囊霉素和易提取球囊霉素的含量，Ca(20)+M 组球囊霉素增加最为明显，总球囊霉素和易提取球囊霉素分别 4.3 和 1.6 mg/g，根际土壤的有机质含量为最大，可达到 8.63 mg/g，和其他处理相比有显著的差异性。
3 讨 论
神东矿区位于干旱和半干旱区，水是限制该地区农业发展的一个限制性因子，煤炭开采往往会造成该地区地面垮塌严重，开采过程中产生的大量裂缝破坏了承压水和地表水分布，使土壤水分大量流失，给矿区农业生产带来不可挽回的损失[30]。玉米是中国重要的粮食作物和饲料作物，也是西部地区主要粮食作物之一，玉米生育期耗水较多且对水分胁迫比较敏感。因此，在干旱缺水的神东矿区，通过一定技术手段缓解干旱对玉米生长影响就变的尤为重要。研究发现，AMF 与外源钙协同作用有利于提高玉米的干质量，促进了苗期玉米生长。 20 mmol/L 外源钙与 AMF 协同作用对玉米生长最优，玉米的干质量、叶片的相对含水率和叶色值含量分别达到 4.03 g/株、91.68%和 43.67，显著高于其他处理。在 AMF 的作用下，玉米的根冠比明显下降(R/S)，这可能是在水分胁迫下，光合产物优先分配给根系，使 R/S 加大，而 AMF 菌丝加大了玉米根系与土壤的接触面积，促进玉米根系对土壤水分和养分的吸收[31]，从而降低了 R/S 值。
氮、磷、钾是作物生长发育必需的三大营养元素，其吸收利用状况影响作物的生长发育和产量以及品质的形成。对于生长在神东塌陷区退化土壤上玉米来说，干旱条件下提高玉米对土壤中养分的吸收，并通过一定技术手段改良塌陷区土壤理化性状，使其更有利玉米生长就变得尤为重要。研究发现，干旱条件下，AMF 能显著提高玉米根系对土壤中氮磷钾的吸收，加菌组地上部分和根系部分 3 种矿质元素增加明显，这可能是丛枝菌根的菌丝可以伸展到矿质元素亏缺区以外，有效地吸收根系不能吸收的矿质元素，更有利于玉米对矿质养分的吸收，促进了玉米的生长。利用 AMF 在煤矿塌陷区土地复垦发现，AMF 能够促进植物吸收矿质养分和水分，提高作物抗逆性和抗病性，改良土壤结构，增强土壤肥力，提高苗木移栽成活率，促进植被恢复。神东矿区塌陷区土壤主要为沙性土壤为主，土壤对水分和养分保持能力较差，而煤炭开采对矿区土壤破坏较大，导致土壤水分和养分流失严重。研究发现，无论加菌与否，通过一定的外源钙都可以缓解采矿带来的不利影响，在施入 Ca 2+ <20 mmol/L 时，玉米地上部分和根系部分氮磷钾累积量随着外源钙浓度增加而增长，说明在低钙体系里，提高钙浓度可以促进氮磷钾吸收;但在高钙体系，当施入 Ca 2+ >20 mmol/L 时，玉米地上部分和根系部分氮磷钾累积量随着外源钙浓度增加而减少，说明高钙对氮、磷和钾的有拮抗关系，当外源钙浓度为 80 mmol/L 时，玉米组织中氮磷钾含量降到最低，抑制了玉米的生长，高浓度 Ca 2+对细胞膜产生破坏，影响离子平衡。当用 20 mmol/L 外源钙与 AMF 协同作用时，玉米的地上部分和根系部分的矿质元素的含量达到最大，两者的耦合效应也达到最大。
AMF 在植物群落结构、演替和稳定性方面具有重要作用，AMF 不但能促进宿主植物对水分和矿质元素的吸收，同时还可缓解逆境对宿主植物生长的影响。干旱条件下，当施入外源钙浓度为 20 mmol/L 时，玉米根系菌根侵染率和菌丝密度为最大，这可能是适当浓度外源钙改变土壤的局部环境，更有利于 AMF 对玉米根系的侵染，此侵染率可达 86.67%，而当外源钙浓度为 80 mmol/L 时，AMF 对玉米根系的侵染率仅为 15.56%，这可能高浓度外源钙使根际土壤盐碱化严重，不利于 AMF 对玉米根系的侵染。球囊霉素产生于 AMF 定居在宿主植物根内的根内菌丝和伸展在根际土壤中的根外菌丝表面，在土壤生态系统中含量不低，因此，它赋予了 AMF 新的生态学功能，近期被更名为球囊霉素相关土壤蛋白，目前认为球囊霉素的主要作用是增加土壤有机碳库和改善土壤团聚体[32-33]。本研究发现，对于接种 AMF 的不同处理来说，玉米根际土壤中球囊霉素和易提取球囊霉素都有不同程度的增加，而没有接种 AMF 的处理无球囊霉素产生，施入一定浓度的外源钙有利于球囊霉素相关蛋白的产生，在施入 Ca 2+ <20 mmol/L 时，根际土壤中总球囊霉素和易提取球囊霉素的含量随着外源钙浓度增加而增加，当施入 Ca 2+ >20 mmol/L，总球囊霉素和易提取球囊霉素的含量随着外源钙浓度增加而减少。施入外源钙的浓度为 20 mmol/L，玉米根际土壤中总球囊霉素和易提取球囊霉素含量最大，分别达到 4.3 和 1.6 m/g，球囊霉素相关蛋白是土壤的一个重要碳源 ， Ca(20)+M 组玉米根际土壤中有机质含量也达到最大。适当浓度的外源钙有利于球囊霉素相关蛋白的形成，这可能是外源钙改变土壤的离子平衡和土壤肥力，改善了土壤根际微环境，提高 AMF 与宿主植物间耦合效应。由此可见，对于矿区退化土壤来说，接种 AMF 有利于矿区土壤的改良，而适当的外源钙更有利 AMF 对宿主植物的作用效果，同时有利于对退化土壤的培肥效果。本研究仅通过室内盆栽试验研究了丛枝菌根对矿区退化土壤的改良效果，若能在矿区实地进行长期的、系统的应用研究，这对菌根技术在矿区退化土壤上的使用更具有指导意义。——论文作者：李少朋 1，毕银丽 1※，陈昢圳 2，Zhakypbek Yryszhan3，刘 生 1
