摘要: 长期不同施肥处理会改变土壤的理化性质和微生物生物量，但长期不同施肥对黄土高原梯田土壤微生物胞外酶活性变化和养分特征的影响尚不清楚. 本研究以中国科学院安塞水土保持综合试验站长期养分定位试验样地为基础，分析了不施肥 ( CK) 、有机肥与氮肥混施( MN) 、有机肥与磷肥混施( MP) 、有机肥、氮肥与磷肥混施( MNP) 、单施有机肥( M) 和氮肥磷肥混施( NP) 对土壤微生物生物量以及土壤胞外酶活性的影响. 结果表明，与 CK 相比，所有施肥处理都显著提高了土壤养分含量和土壤胞外酶活性. 相关分析表明，土壤胞外酶活性与土壤理化性质成极显著的相关关系，冗余分析显示土壤养分和土壤微生物生物量可以分别解释土壤胞外酶活性及其化学计量比变化的 79. 66% 和 74. 87% ，即施肥主要是通过影响土壤肥力间接影响土壤胞外酶活性. 单施有机肥或有机肥配施无机肥( M、MN、MP 和 MNP) 均可以显著提高土壤有机碳( SOC) 和土壤总氮( STN) 以及碳( C) 源酶、氮( N) 源酶和磷( P) 源酶的含量，但 MNP 处理会使土壤酸碱度发生改变，对微生物的生命活动产生抑制作用. 矢量分析表明，所有处理的微生物群落均处于磷限制状态，MNP 处理虽然可以缓解磷限制的程度，但与 M 和 MP 处理之间没有显著性差异. 本研究表明，长期单施有机肥[7 500 kg·( hm2 ·a) - 1 ]可以满足旱地作物生长的养分需求，长期有机肥与磷肥混施可以缓解土壤微生物面临的资源限制，该结果对改善区域氮肥过量提供了新思路.
关键词: 黄土高原; 长期施肥; 化学计量; 胞外酶活性; 梯田
土壤微生物作为陆地生态系统的重要组成部分，通过生长代谢促进了土壤有机质的降解和腐殖质的形成，调控着土壤养分的转化和积累[1，2]. 土壤微生物产生的胞外酶可以参与土壤中几乎所有的化学反应，并对外界环境条件的变化保持高度的敏感性[3]. 因此，土壤胞外酶活性的变化可以表征土壤养分的动态特征，在生态系统的生物地球化学平衡过程中起着至关重要的作用[4，5].
长期施肥可以改变土壤的养分状况和微生物活性，使土壤胞外酶活性发生改变，但是不同施肥处理对土壤胞外酶活性的影响并不一致[6]. 长期施用化肥或有机肥会显著提高土壤胞外酶的活性[7]，但是长期施用磷肥会使土壤中磷( P) 源酶活性降低，氮 ( N) 源酶和碳( C) 源酶活性升高[3]，而 Dong 等[8]的研究发现施用 P 肥可以提高 N 源酶和 C 源酶的活性. 施肥种类和施肥制度会对土壤胞外酶活性产生不同的影响，打破生态系统的养分平衡，并加剧生态系统的养分限制[9].
生态化学计量学使用元素的化学计量比预测土壤营养的保留状况[10]，土壤胞外酶化学计量学是将元素化学计量学和微生物养分的吸收和生长联系起来[11]. Sinsabaugh 等[12]的研究提出采用与 C、N 和 P 相关的胞外酶化学计量表示对微生物代谢的相对限制，Moorhead 等[13]的研究提出利用胞外酶化学计量的矢量长度和矢量角度表征微生物群落的相对资源需求. 钟泽坤等[14]对农田撂荒后土壤微生物养分限制状况研究发现: 土壤微生物 C 限制随撂荒过程逐渐减弱，且撂荒前期微生物受 N 限制，后期受 P 限制，崔继文等[15]的研究发现习惯施肥和优化施肥会加剧微生物 C 限制，但有机肥替代化学氮肥可以通过提高土壤的养分含量解除土壤微生物的 C 限制，并显著减轻土壤微生物的 P 限制. 探究不同施肥处理与土壤微生物资源限制的关系，对改善农田生态系统功能具有重要意义.
黄土高原位于中国西北部，水土流失和土地退化严重，农田肥力低下，生态环境脆弱. 目前对于土壤胞外酶活性的研究多集中在森林、草地生态系统，对农田生态系统关注较少，但农田生态系统的质量与土壤胞外酶活性息息相关，且长期施肥与短期施肥对土壤微生物资源限制的影响不同. 因此，本研究以接近 30 a 的野外定位施肥试验为平台，分析长期施肥条件下土壤养分和土壤胞外酶活性的变化特征以及长期施肥对土壤微生物资源限制的影响，以期为黄土高原农田制定合理的施肥制度提供科学依据.
1 材料与方法
1. 1 研究区概况
本研究在陕西省延安市安塞水土保持研究站 ( 36° 51'31″ N，109° 19'23″ E) 的墩山梯田养分长期定位试验田进行，该区域位于黄土沟壑区. 海拔 1 067 ～ 1 309 m，属于暖温带半湿润向半干旱过渡区，年均温 8. 8℃，无霜期为 143 ～ 174 d，年平均降雨量 540 mm，主要集中在 7 ～ 9 月. 土壤类型为黄绵土( 联合国粮农组织的土壤分类标准) . 试验样地建立于 1992 年，采用随机区组设计共 24 个试验小区，包括 6 个处理( CK、MN、MP、MNP、M 和 NP) ，4 个区组重复. 本试验的供试氮肥为尿素、供试磷肥为过磷酸钙，供试有机肥为羊粪，各处理具体施肥情况见表 1. 各小区面积为 30 m2 ( 8. 75 m × 3. 5 m) ，小区之间间距为 50 cm，有水泥和砖堆砌的田埂，样地四周设置了高 1. 5 m 的铁围栏. 样地采用谷子-糜子-谷子-大豆轮作的种植制度，采用小型机械耕作，一年一熟，无灌溉.
1. 2 样品采集
2019 年 10 月中旬，在每个施肥处理小区，使用直径为 5 cm 的土钻按照“S”型采集 5 钻 20 cm 的表层土壤，并将其均匀混合成一个复合样品，样品经 2 mm 的筛子筛去根系和其他碎屑，随后低温运回实验室. 一部分冷藏于 - 20℃ 用于测定土壤胞外酶活性; 一部分冷藏于 4℃ 用于测定土壤微生物生物量和土壤水溶性养分; 第三部分自然风干后分成两部分，分别通过 1 mm 和 0. 25 mm 筛用于测定土壤基本理化性质.
1. 3 样品指标测定
本研究测定的指标包括: 土壤含水率( SWC) 、土壤容重( SBD) 、土壤有机碳( SOC) 、土壤总氮 ( STN) 、土壤总磷( STP) 、土壤微生物生物量碳 ( MBC) 、土壤微生物生物量氮( MBN) 、土壤微生物生物量磷( MBP) 、水溶性有机碳( DOC) 、水溶性有机氮( DON) 、土壤有效磷 ( SAP) 和土壤胞外酶活性.
SWC 采用烘干法测定; SBD 采用环刀法测定; 土壤 pH 采用电位法( 水土比 = 2. 5 ∶ 1) 测定[16];SOC 采用 H2 SO4-K2Cr2O7 氧化容量法测定[16]; STN 采用凯氏定氮法测定[16]; STP 采用钼锑抗比色法测量[16]; DOC 采用元素分析仪( Liqui TOCII，德国) 测定; DON 采用紫外分光光度计双波长法测定; SAP 采用碳酸氢钠浸提和钼锑抗比色法测定[16]; MBC、 MBN 和 MBP 采用氯仿熏蒸法[17，18]测定; 5 种土壤胞外酶活性采用 96 微孔荧光法测定[19]，具体操作参考 German 等[20]研究的方法，土壤胞外酶活性以干土计，单位为nmol·( g·h) - 1 ，本研究测定的土壤胞外酶活性基本信息见表 2.
1. 4 数据分析
土壤胞外酶活力的矢量特征计算[21]: 矢量长度代表土壤微生物所受到的 C 限制，矢量角度代表 N 限制或者 P 限制，矢量角大于 45°表示 P 限制，小于 45°表示 N 限制.
2 结果与分析
2. 1 土壤理化性质和养分含量的变化
由表 3 和表 4 可知，长期施肥条件下各处理的 SOC 和 STN 含量均显著高于 CK 处理，MN、MP、 MNP 和 M 处理的 SOC 和 STN 含量之间没有显著差异，但是显著高于 NP 处理. 所有处理的 STP 和 SAP 含量变化一致，为 MP > MNP > NP > M 或 MN，且都高于 CK，所有施肥处理的 SCN 不存在显著性差异，但是 CK、MN、MP 和 NP 处理的 DCN 显著高于其他处理. CK 处理的 SCP 和 SNP 显著低于其他处理，但是 CK 的 DCP 和 DNP 却显著高于其他处理.
2. 2 土壤微生物生物量的变化
长期施肥处理对土壤微生物生物量及其化学计量比产生了显著差异( 表 5 ) . M 和 MP 处理的 MBC 含量显著高于其他处理，MN 和 MNP 的 MBC 含量显著低于 M 和 MP 的 MBC 含量，显著高于 NP 和 CK 的 MBC 含量. MN 处理的 MBN 含量和 MNP 处理的 MBP 含量显著高于其他处理， NP 处理和 CK 处理的 MBN 含量没有显著性差异. MCN 在 M 处理下最高，CK 处理下最低，对于 MCP，MNP 处理显著低于其他处理，其他处理之间没有显著性差异，但是 CK 的 MBN∶ MBP 远远高于其他处理( MN、MP、MNP、M 和 NP) ，除 CK 之外的其他处理的 MBN∶ MBP 含量没有显著性差异.
2. 3 土壤胞外酶活性的矢量分析和微生物资源限制
不同施肥处理下的 C、N 和 P 源酶活性都存在显著性差异，MN、MP、MNP 和 M 处理下的 BG + CBH 和 NAG + LAP 显 著 高 于 NP 和 CK，MN、 MP 和 M 处理的 AP 没有显著性差异，但是显著高于 NP 和 CK 处理[图 1( a) ～ 1( c) ]. CK 的酶 C∶ N 和酶C∶ P均低于其他施肥处理，各施肥处理的酶 C∶ N、酶 C∶ P 和酶 N∶ P 均没有显著性差异[图 1 ( d) ～ 1( f) ]. 土壤胞外酶活性的矢量分析显示: 所有处理的矢量角均大于 45°，即全部处于微生物 P 限制状态，但 MNP 和 NP 处理所受 P 限制较弱，CK 和 MN 所受 P 限制较强. 由矢量长度可知，各处理均处于微生物 C 限制状态，但是各处理之间没有显著性差异( 图 2) .
2. 4 土壤胞外酶活性与土壤养分、土壤微生物生物量的关系
相关 分 析 表 明，SBD、SOC 和 TN 与 MBC、 MBN、MBP、BG + CBH、NAG + LAP 和 AP 具有显著相关性( P < 0. 05) ，SCP 和 SNP 与 C、N 和 P 源酶活性具有极显著相关关系( P < 0. 01) ( 表 6) . 冗余分析显示: 土壤碳氮磷及其化学计量比和土壤微生物生物量及其化学计量比可以分别解释土壤胞外酶活性及其化学计量比变化的 79. 66% 和 74. 87% ( 图 3) ，表明施肥主要通过改变土壤养分以及土壤微生物数量来改变土壤胞外酶活性.
3 讨论
3. 1 长期不同施肥对土壤养分与微生物量的影响
有机肥具有改善土壤质量、提高作物产量和减少环境污染等优点[22]，因此在农业生产中受到广泛使用. 本研究进一步证实了有机肥可以显著提高 SWC、SOC、TN、DOC 和 DON 的含量( 表 2) . 这可能是由于有机肥自身含有大量的 C 和 N 等营养元素[23]，也有可能是因为有机肥被土壤分解过程中产生了有机酸，有机酸促进养分的释放和有效性[24]. 但是，本研究中 M、MN、MP 和 MNP 处理的 SOC、STN、 SOC∶ STN 和 DOC 含量没有显著差异，这可能是由于本试验施肥年限较长，养分累积出现饱和状态.
土壤微生物是土壤养分转化的促进者，也是养分元素循环利用和有机质矿化的主要调控者，土壤微生物量高低的变化是反映土壤肥力的重要依据[25]. 本研究结果表明，M、MN、MP 和 MNP 处理均可以显著提高土壤 MBC、MBP 和 MBN 含量. 这可能是因为长期施用有机肥能直接向土壤提供大量的 C、N 和 P 等元素，促进了微生物的生长繁殖[26].同时外源氮肥磷肥的施入不仅调节了土壤氮素的供应能力，也改善了磷素的有效性[27 ～ 29]，因此导致 4 个处理之间的 MBN∶ MBP 没有差异性. 其中，MNP 处理的 MBC∶ MBP 显著小于其他处理可能是因为 NP 的施入加剧了土壤的相对 C 限制，导致 MBC 含量减少，其次可能因为作物的生物量和产量加剧了对土壤 C 源的消耗，加之 P 的施入，导致 MBC∶ MBP 降低.
3. 2 不同施肥处理对酶活性的影响
土壤胞外酶在有机质分解和养分循环过程中发挥着重要作用，资源分配理论指出[30]，微生物在受到单一元素限制时会增加与该元素对应的胞外酶的合成，以满足自身养分需求. 本研究发现长期施肥处理相比 CK 能显著提高土壤胞外酶的活性，这是因为长期的养分输入改变了土壤的理化性质，增加了土壤真菌和细菌的多样性，衍生了更多的微生物群落，从而导致各个施肥处理下胞外酶活性增加[31].其次，本研究验证了有机肥无机肥混施和化肥混施对土壤酶活性的影响，即有机肥无机肥混施( MN、 MP 和 MNP) 更能提高土壤中的酶活性[7]. 但是，本研究 发 现 长 期 有 机 肥 无 机 肥 混 施 ( MN、MP 和 MNP) 或单施有机肥( M) 对 C 源酶和 N 源酶的活性没有显著性差异，这可能是由于长期混施有机肥造成土壤养分环境达到相对一致的水平，因为有机肥相比化肥可以更明显地促进土壤中团聚体的生成， 改善土壤结构，增加土壤肥力[32]. 在本研究中，MNP 和 NP 处理的 AP 活性显著低于其他处理，可能是由于 P 肥的添加对 AP 活性的抑制作用，已有研究证实 AP 活性和 SAP 之间存在负相关关系[33]，本研究的结果也证实这一结论. 此外，CK 和 NP 的 N 源酶和 P 源酶活性虽然没有显著差异，但是两者胞外酶活性的变化机制不同，CK 处理是由于养分限制而促进胞外酶活性升高，NP 处理则是微生物为了维持稳态而使胞外酶活性升高[34，35]. 因此，有必要增加单施 N 肥或 P 肥的处理，以便于更好地理解长期单施化肥对胞外酶活性的影响以及化肥混施对胞外酶活性影响的复杂机制，但是本研究仍然为长期施肥对黄土高原农田土壤胞外酶活性变化提供了参考.
3. 3 不同施肥处理对微生物资源限制的影响
土壤胞外酶的化学计量学特征，可以反映微生物代谢情况和营养需求与环境养分有效性之间的平衡，对实施生态系统养分管理措施具有重要指导意义[12]. 根据相关研究，全球尺度上土壤胞外酶活性的 ECN、ECP 和 ENP 平均值分别为 1. 41、0. 62 和 0. 44 [36]，本研究的矢量分析表明，所有施肥处理的矢量角大于 45°，因此都处于 P 限制状态( 图 2) ，又因为 ECP 远远低于全球平均值 0. 62，因此所有处理也存在相对 C 限制. MP、MNP、M 和 NP 处理的矢量角度没有显著性差异，说明存在相同程度的 P 限制，其原因可能是每年作物收获带走了土壤养分，造成当年施入的 P 没有保存在土壤内，导致土壤始终处于 P 素亏缺状态[37，38]. 也有可能是因为施 P 的同时加施 N 或 M 会使土壤 C∶ P 或 N∶ P 升高，导致土壤微生物容易受到 P 限制. 因此，本试验中的 P 素处理只是在一定程度上减轻了微生物的 P 限制，并没有解除微生物 P 限制.
3. 4 影响土壤胞外酶活性及其化学计量比的因素
土壤胞外酶活性对土壤养分循环、能量流动以及生态系统稳定性具有非常重要的作用. 本研究发现 SOC 和 STN 与土壤 C 源酶、N 源酶和 P 源酶都具有极显著相关关系( 表 6) ，并且土壤全养分与土壤微生物生物量对胞外酶活性及其计量比的变异解释分别为 79. 66% 和 74. 87% ，说明施肥通过改变土壤肥力以及微生物的活性间接影响胞外酶活性. 这与 Wu 等[38]和田静等[39]的研究结果一致，因为肥料的施入会改变土壤的 SWC 和 SBD 等物理性质，进而改变土壤的无机组分和化学组成，改变真菌和细菌的群落结构，提高微生物的活性. 但与 Zhang 等[40]的研究结果不一致，这可能是由于生态系统类型和土地利用方式的不同. 本研究中，并没有发现可溶性养分与土壤胞外酶活性的密切联系，这可能是因为养分的有效化过程取决于土壤胶体吸收性离子的有效程度，而不是可溶性养分的含量.
4 结论
( 1) 长期不同施肥处理显著提高了 SOC、STN、 STP、DOC、DON、SAP、MBC、MBN 和 MBP 的含量，以及土壤 BG + CBH、NAG + LAP 和 AP 的活性.
( 2) 所有施肥处理都受到 P 限制，MNP 和 NP 处理可以显著降低 P 限制.
( 3) 土壤全养分、可溶性养分、土壤微生物生物量可以分别解释土壤胞外酶活性及其计量比变化的 79. 66%、44. 92% 和 74. 87% ，SOC 和 TN 含量与胞外酶活性存在极显著性相关关系( P < 0. 01) ， DOC 和 DON 含量与胞外酶活性存在显著性相关关系( P < 0. 05) .
( 4) 长期施用 MNP 会使土壤 pH 降低，抑制微生物活动和土壤胞外酶活性.
( 5) 所有处理均处于相对 N 饱和状态，每年施用7 500 kg·hm - 2 的有机肥可以满足农田作物对 C 和 N 的养分需求，另需外源施加 P 肥以应对长期缺 P 的现状，但是最佳施 P 量还需要进一步探究.
致谢: 特别感谢安塞农田生态系统国家观测站的吴瑞俊等老师对本研究的长期支持.——论文作者：吴春晓1，2 ，高小峰1，2 ，闫本帅1，2 ，梁彩群3 ，陈佳瑞3 ，王国梁1，3 ，刘国彬1，3*
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