摘要: 采用三相法( TPP) 分离纯化番薯过氧化物酶( SPP) ，以番薯过氧化物酶的酶活回收率和纯化倍数为优化目标，分别利用单因素法和响应面分析法对其影响因素进行考察。建立了最佳提取条件: 以叔丁醇作溶剂、硫酸铵饱和度为 66%、粗提物与叔丁醇体积比为 1. 0 ∶1. 13、温度为 26℃、pH = 5. 0，在最优提取条件下，其酶活回收率和纯化倍数分别达 133. 5%和 3. 5。 SDS-PAGE 电泳分析结果显示 SPP 酶蛋白主要为一条带，其分子质量约为 40 kDa 左右。三相法操作简便、耗时短、成本低，此外分离过程增强了 SPP 酶与底物的亲和力，提高了酶活回收率，有利于工业化应用。
关键词: 三相分离; 番薯过氧化物酶; 酶活回收率; 纯化倍数; 响应面分析
过氧化物酶( Peroxidase，POD，EC1. 11. 1. 7) 是广泛存在于自然界的一类氧化还原酶，催化有过氧化氢参与的多种氧化反应，属含血红素的氧化酶。 2007 年，Alpeeva 等 发 现 番 薯 过 氧 化 物 酶 ( sweet potato peroxidase，SPP) 较辣根过氧化物酶在分析检测反应中具有更高的灵敏度，且发光时间长、稳定性高[1]。目前番薯过氧化物酶在环保行业、食品工业、医疗诊断、生物传感器等行业应用普遍[2]。通常利用丙酮分级分离、双水相萃取方法将过氧化物酶初步分离，再利用硫酸铵分级沉淀法进一步纯化。但这些分离提纯方法存在操作过程复杂、耗时长、失酶量大、提取率低等缺点。近年来，三相法逐步取代盐析法应用于酶的分离纯化，是指在粗酶液中加入盐和有机溶剂并将其混匀，离心静置后分层形成三相，上层有机相是有机溶剂，中间沉淀相是酶蛋白沉淀，下层水相主要包含极性化合物。三相法操作简便、耗时短，真正做到了一步分离，酶活回收率和纯化倍数也较其他多步分离方法高，有利于工业化应用[3-7]。目前尚未见关于利用三相法分离纯化番薯过氧化物酶的研究报道。
笔者采用三相法分离纯化番薯过氧化物酶，以 SPP 的酶活回收率和纯化倍数为优化目标，利用单因素法和响应面分析法对三相分离的影响因素进行考察和优化。通过扫描电镜( SEM) 观察分析了酶蛋白沉淀的微观结构，并利用 SDS-PAGE 电泳测得了 SPP 的分子质量。
1 材料、试剂与仪器
1. 1 材料与试剂
番薯( 本地超市购买) 。无水乙醇、叔丁醇、正丁醇、乙腈、异丙醇、1，4-丁二醇、硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、愈创木酚、氢氧化钠、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠、氯化钠，AR，国药集团化学试剂有限公司生产; 考马斯亮蓝( G250) 、牛血清蛋白，索莱宝生物生产。
1. 2 仪器
80-1 型医用离心机，江苏新康医疗器械有限公司生产; XK96-A 型快速混匀器，上海磊固仪器有限公司生产; TU-1901 型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产; PH-100A /100B 笔式 pH 计，邦西仪器科技上海有限公司生产; EVO18 扫描电子显微镜，德国蔡司公司生产。
2 实验方法
2. 1 番薯过氧化物酶粗提液的制备
将新鲜番薯皮洗净晒干，用搅拌器粉碎，过 200 目筛。取适量搅碎的番薯皮加入其 4 倍体积的蒸馏水，室温浸泡 2 h 后，用 4 层纱布过滤并收集滤液，将其所剩滤渣复提 1 次，再合并 2 次所得滤液，在 4 000 r /min 下离心 10 min，收集上层清液即为番薯过氧化物酶粗提液，放入 4℃冰箱中保存备用。
2. 2 三相法分离纯化番薯过氧化物酶
取一定体积的粗提液，边震荡边加入研磨后的硫酸铵使粗提液达到一定饱和度，持续震荡 2 min 使其完全溶解，按一定体积比加入有机溶剂用混匀器混匀后于室温静置 1 h，逐渐形成三相体系。将体系在 4 000 r /min 下离心 10 min，使中间相浓缩成片状蛋白沉淀。除去上层有机相和下层水相，并收集中间沉淀相，依次用少量清水和缓冲液淋洗，即得番薯过氧化物酶。用适量 pH = 6. 0 磷酸盐缓冲溶液 ( PBS) 使 中 间 沉 淀 相 溶 解，蒸馏水稀释定容至 10 mL，对其酶活和蛋白浓度进行测定分析。
分别考查溶剂类型、硫 酸 铵 饱 和 度 ( 30% ～ 80%) 、溶剂用量( 1 ～ 8 mL) 、温度( 20 ～ 40℃ ) 、pH ( 3 ～ 8) 等因素对番薯过氧化物酶的酶活回收率和纯化倍数的影响。
2. 3 响应面分析法优化三相分离提取工艺
在单因素考察结果的基础上，选取叔丁醇用量 ( A) 、硫酸铵饱和度( B) 、温度( C) 3 个因素为自变量，以酶活回收率和纯化倍数为响应值，进行 3 因素 3 水平的响应面分析。利用 Design - Expert 8. 0. 6 Trial 应用软件对实验进行设计，并对响应结果进行分析 处 理[8-9]。响应面分析因素与水 平如表 1 所示。
2. 4 番薯过氧化物酶酶活力的测定
利用愈创木酚法测定番薯过氧化物酶的活力[2]。取 2. 0 mL 含 0. 045 mol /L 愈创木酚和 0. 05 mol /L 的过氧化氢，pH= 6. 0 的 PBS 缓冲液，再加入 100 μL 酶液。利用紫外-可见分光光度计检测在 90 s 时 SPP 在 470 nm 处的吸光度变化值。
酶活力的定义: 以 25℃下每分钟转化 1 μmol 底物定义为一个酶活单位( U) 。
2. 5 蛋白浓度的测定
采用 Bradford 法 进 行 测 定，以 牛 血 清 蛋 白 ( BSA) 为标准蛋白[10]。
2. 6 扫描电镜分析( SEM)
将粗酶液、三相分离法得到的中间沉淀相和三相分离过程得到的下层水相进行透析处理，真空冷冻干燥 24 h，用 S-4800 型高分辨场发射扫描电镜对其蛋白沉淀的结构进行观测及分析。
2. 7 SDS-PAGE
SDS-PAGE 采用 Laemmli 法进行测定[11]。
3 结果与讨论
3. 1 三相分离的单因素优化
3. 1. 1 溶剂对 SPP 三相分离结果的影响
通过正丁醇、乙腈、叔丁醇、异丙醇和 1，4-丁二醇考察有机溶剂对 SPP 三相分离效果的影响，结果如表 2 所示。由表 2 可以看出，在硫酸铵饱和度为 60%、pH = 5. 0、温度为 20℃、溶剂用量与粗酶液等体积条件下，用叔丁醇作溶剂时酶活回收率和纯化倍数达最高，分别为 130. 8%和 2. 4。叔丁醇可以降低体系的介电常数，增大酶蛋白上带电基团间的静电作用力，促使其发生聚集而形成三相。此外，叔丁醇有较高的分子尺寸而不会渗透到酶蛋白折叠的三维结构内，因此不会引起酶的变性[12]。三相法大大提高了 SPP 的酶活回收率( 大于 100%) ，这是由于在三相分离过程中改变了酶的构象，使其变得与底物更为亲和。
3. 1. 2 硫酸铵饱和度对 SPP 三相分离结果的影响
硫酸铵饱和度在三相分离中起着重要作用，因为其负责蛋白间的相互作用，利用盐析机理使蛋白沉淀。在快速震荡、pH = 5. 0、温度为 20℃ 的条件下，改变硫酸铵饱和度从 30%增加至 80%，并按体积比 1 ∶1加入叔丁醇。硫酸铵饱和度对 SPP 三相分离的 影 响 如 表 3 所 示。由 表 3 可 以 看 出，随 着 ( NH4 ) 2 SO4 饱和度的增加，SPP 的酶活回收率和纯化倍 数 在 饱 和 度 为 60% 时 达 最 高 点，分 别 为 139. 5%和 2. 7。( NH4 ) 2 SO4 饱和度进一步增加时，中间相的 SPP 的选择性分配减少，酶活回收率和纯化倍数降低，也许是过高的硫酸铵饱和度会导致酶失活的原因。
3. 1. 3 叔丁醇用量对 SPP 三相分离结果的影响
在硫酸铵饱和度为 60%、pH = 5. 0、温度为 20℃ 时，粗提液与叔丁醇的体积比对 SPP 三相分离的影响如表 4 所示。由表 4 可以看出，随着叔丁醇用量的增加，SPP 的酶活回收率和纯化倍数均先增加后减少，体积比为 1 ∶ 1时酶活回收率和纯化倍数达最高，分别为 128. 0%和 1. 8。体系中加入叔丁醇后，其从水相中吸引了更多的水，水相中的盐浓度增加，使酶蛋白在界面处沉淀。但继续增加叔丁醇用量，两相之间的浓度梯度减小，反而降低了 SPP 的分离效果。
3. 1. 4 温度对 SPP 三相分离结果的影响
温度是影响酶和体系整体稳定性的重要参数。在粗酶与叔丁醇体积比为 1 ∶ 1、硫酸铵饱和度为 60%、pH = 5. 0 的条件下，温度对 SPP 三相分离结果的影响如表 5 所示。由表 5 可以看出，随着温度的升高，酶活回收率和纯化倍数先增加后减小。在 25℃时 SPP 的酶活回收率和纯化倍数达最高，分别为 123. 6%和 3. 3。在 20 ～ 25℃条件下，叔丁醇会产生明显的渗透性和拥挤效应，增强 SPP 的分配，而温度为 25℃以上时，渗透和拥挤效应明显减弱，酶的热失活反而使酶活性和纯化因子降低[11]。
3. 1. 5 pH 对 SPP 三相分离结果的影响
pH 的变化促进了目标蛋白质净电荷的变化并影响蛋白质的分配行为[13]。在( NH4 ) 2 SO4 饱和度为 60%、粗酶液与叔丁醇体积比为 1 ∶1、温度为 25℃ 的条件下，研究不同 pH( 3 ～ 8) 对番薯过氧化物酶三相分离的影响，结果如表 6 所示。由表 6 可以看出，在 pH = 5. 0 时获得了最高酶活回收率和纯化倍数，分别为 133. 9%和 3. 4，所以 pH = 5. 0 为三相分离中的最佳验点。
3. 2 响应面分析法优化 SPP 三相分离提取工艺
试验组的试验方案及结果如表 7 所示。回归模型方差分析结果如表 8 所示。
3. 2. 1 各因子交互作用对 SPP 酶活回收率的影响
各因子交互作用对 SPP 酶活回收率的交互影响如图 1 所示。由图 1 可以看出，温度和硫酸铵饱和度的交互作用对酶活回收率的影响较大。由等高线图可以看出，沿硫酸铵饱和度轴向的等高线变化密集，而沿温度轴向等高线变化稀疏，说明硫酸铵饱和度对酶活回收率大小的影响比温度更大。由 Box -Behnken Design 软件分析得到较高酶活回收率的三相分离提取的最佳工艺结果为: 叔丁醇用量为 4. 06 mL( 粗酶液体积为 4 mL) ，硫酸铵饱和度为 64. 91%，温度为 25. 87℃，理论上预测酶活回收率大小为 133. 5%。
3. 2. 2 各因子交互作用对 SPP 纯化倍数的影响
各因子交互作用对 SPP 纯化倍数的交互影响如图 2 所示。由图 2 可以看出，硫酸铵饱和度和叔丁醇的交互作用对纯化倍数的影响较大。由等高线图中可以看出，沿叔丁醇用量轴向的等高线变化密集，而沿硫酸铵饱和度轴向的等高线变化稀疏，说明叔丁醇用量比硫酸铵饱和度更能影响纯化倍数的大小。由 Box-Behnken Design 软件分析得到较高纯化倍数的三相分离提取的最佳工艺结果为: 叔丁醇用量为 4. 8 mL ( 粗 酶 液 体 积 4 mL) ，硫酸铵饱和度为 64. 59%，温度为 25. 49℃，理论上预测纯化倍数大小为 3. 5。
3. 3 扫描电镜( SEM) 形貌分析
粗提法和三相法所得 SPP 酶的 SEM 图如图 3 所示。
由图 3 可以看出，粗提液中 SPP 酶蛋白沉淀的微观形态结构为聚集在一起的球状颗粒。而三相分离法形成的 SPP 酶蛋白沉淀的微观形态结构主要为光滑的片状结构。三相分离法所得的 SPP 是由于硫酸铵和叔丁醇的共同作用，受多方面作用力影响而形成较明显的片状结构，并迁移到中间相并沉淀。
3. 4 SDS-PAGE 电泳分析
将三 相 分 离 法 所 得 的 SPP 溶 液 进 行 SDS - PAGE 电泳分析，结果如图 4 所示。由图 4 可以看出，番薯过氧化物酶的分子质量大小为 40 kD 左右，该分子质量在不同来源的过氧化物酶的分子质量范围之内[14-15]。三相法分离所得到的酶蛋白沉淀的球状颗粒周围的杂蛋白含量相较于粗提液明显要少。
4 结论
以酶活回收率和纯化倍数为考察指标，对三相法提取番薯过氧化物酶的工艺条件进行优化。在单因素实验的基础上，选取叔丁醇用量、硫酸铵饱和度、温度 3 个因素为自变量，以酶活回收率和纯化倍数为响应值，根据 Box-Behnken 设计原理，采用 3 因素 3 水平的响应面分析法确定最佳工艺。结果表明，以叔丁醇为溶剂，在硫酸铵饱和度为 66%，粗提物与叔丁醇体积比为 1. 0 ∶ 1. 13，温度为 26℃，pH = 5. 0 的条件下，其酶活回收率和纯化倍数分别达 133. 5%和 3. 5。三相法操作简便、耗时短、成本低，此外分离过程增强了 SPP 酶与底物的亲和力，大大提高了酶活回收率，有利于工业化应用。——论文作者：蔡 燕，姜路云，陈华旺，韩丽玮* ，吴锦明
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