摘 要 本研究应用 DNA 条形码技术，以 ITS 序列为目的片段对口岸截获的拟石莲属多肉植物进行快速鉴定。对 11 种 36 份拟石莲属供试样本 ITS 片段进行通用引物扩增，并双向测序拼接，利用 MEGA7 软件进行序列比对，分析各种类种内和种间 K2P 遗传距离，构建系统发育树。研究表明，供试材料 ITS 序列的种内差异显著小于种间差异，种内种间差异存在明显的间隔区，所有样品按种类在 NJ 树上严格聚成单系，种间区分明显。经初步判定，ITS 具有作为拟石莲属多肉植物 DNA 条形码的潜在可能。
关键词 拟石莲属;DNA 条形码;ITS
近年来，多肉植物日益受到园艺爱好者青睐，景天科拟石莲属就是其中之一 [1]。拟石莲属也称石莲花属，种类繁多，据记载有 167 个原始种，主要分布于美国南部、墨西哥以及中美洲各国 [2]，因其叶片排列呈莲座状而得名。拟石莲属多肉植物主茎短粗，部分种类主茎有分支，叶片丛生、肉厚，叶色多变，形状美观，同时兼具耐干旱、易繁殖的特点，因此，拟石莲属多肉植物在我国也受到消费者追捧 [3]。
由于产地原因，我国的拟石莲属多肉植物，特别是罕见品种主要依赖从国外引进，进境数量逐年增加。另外，由于部分园艺爱好者不了解口岸检疫相关法律法规，加之不法商家铤而走险，近年来，私自携带、邮寄等非法入境的拟石莲属植物逐年增多。非法入境的拟石莲属多肉植物虽然具有观赏价值，但由于是活体植物，可以在国内定殖，而目前国内生态环境中缺乏能对其产生制约作用的天敌，造成生物入侵风险很高 [4]。未经检疫非法入境的活体植物及其栽培基质极有可能携带昆虫虫卵、活虫、病毒、线虫和病原真菌等有害生物。相关报道显示，已有交链孢霉、单齿线虫、茎线虫以及石蒜绵粉蚧等有害生物从截获的多肉植物及其栽培土中被发现 [5]，给我国农业生产和生态环境安全造成危害。
目前，拟石莲属多肉植物仍主要依赖形态学特征进行分类 [6]，但该属各种植物叶形相似，叶色多变，形态学种类鉴定受制于鉴定人员的经验与能力，因此亟待建立分子生物学鉴定方法作为补充。本研究以 DNA 条形码(DNA barcoding)的方法，选用植物鉴定最常用的 DNA 条形码 ITS 基因为研究对象 [7]，利用该基因片段长度适中、扩增和测序效率高等特点，通过分析 ITS 基因的遗传信息，精准高效地对拟石莲属多肉植物进行分类鉴定，填补国内相关领域研究空白。
1 材料与方法
1.1 供试材料
共收集拟石莲属多肉植物 11 种，分别为绿爪、卡罗拉、丽娜莲、吉娃娃、冰梅、苯巴蒂斯、碧桃、蓝苹果、火焰蒂亚、锦晃星、静夜，所有供试材料均为口岸截获的多肉植物活体植株。
1.2 样本DNA提取及PCR扩增
取样本 30 g，加入适量液氮充分研磨，选用天根植物 DNA 提取试剂盒(TIANGEN DP305-03)提取样本总 DNA。用引物ITS-F(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和 ITS-R(5'-CCGCAGGTTCACCTACGGA-3')进行 PCR 扩增 [8]。PCR 反应体系总体积 30 μL，其中，2×Emerald Amp Max PCR Master Mix 15 μL，上下游(F, R)引物各 2 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2 O 补足剩余。
PCR 体系反应条件：预变性，94℃ 5 min;变性， 94℃ 30 s， 退 火，56℃ 30 s， 延 伸，72℃ 30 s，35 个热循环;终延伸，72℃ 7 min;反应结束，4℃ 保存。
使用 1% 琼脂糖凝胶进行 PCR 扩增产物电泳验证，对扩增产物进行双向测序并对结果进行分析。
1.3 数据处理与分析
采用 SeqMan 软件分析测序结果，手工矫正测序图谱，去掉两端引物区序列以及测序低质量序列，拼接后获得 ITS 基因目标序列。运用序列分析软件 MEGA7(Molecular evolutionary genetics analysis)对拼接序列进行多重序列比对分析和人工校验。基于 K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算各物种种内和种间 K2P 遗传距离，运用邻接法(NJ 法)对所得序列分析结果构建系统发生树。
2 结果分析
2.1 ITS基因种内种间遗传变异分析
拟石莲属 11 种 36 份供试样本均扩增得到 ITS 基因目的片段，双向测序成功并完成了序列拼接。 11 种 36 份样本的 ITS 基因序列长度大小一致，为 651 ～ 654 bp，各种类之间 GC 含量差异不大，平均为 56.77%，见表 1。
基于 K2P 模型的遗传距离分析表明，所有供试样本 ITS 序列最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离。苯巴蒂斯和火焰蒂亚种内变异最大，K2P 种内遗传距离均为 0.0063;种间遗传距离最小的是锦晃星和静夜，最小 K2P 种间遗传距离为 0.0079，平均种间遗传距离为 0.0095;种间遗传距离最大的为碧桃和卡罗拉，最大 K2P 种间遗传距离为 0.0594，平均种间遗传距离为 0.0582。间隔区(Barcoding gap)图显示，各种类种内遗传距离明显小于种间遗传距离(表 2)，种内遗传距离与种间遗传距离呈两端分开趋势，两者之间有明显的间隔区，如图 1 所示。
2.2 聚类分析
在基于 ITS 序列构建的 NJ 树中(图 2)，NJ 树各分支较长，表明各种供试样本 ITS 序列种间差异显著，种类区分明显。景天属多肉植物漫画汤姆作为外群单独为一支，与供试的拟石莲属多肉植物样本差异显著。供试的 11 种拟石莲属多肉植物各种之间能够明确区分，36 个样本按种类各自聚为一支，不同种类的样本位于不同的分支，没有物种聚类交叉，其中，苯巴蒂斯种内变异最大，锦晃星与静夜有相对较近的亲缘关系，与 K2P 遗传距离分析结果吻合。
3 讨论
拟石莲属多肉植物因其外形似莲花状，叶色斑斓，花形独特，还兼具品种多样、不凋零的特质而备受欢迎 [9]。但因我国在多肉植物杂交、育种方面研究较少，缺乏自主知识产权，中高档、观赏性强的多肉植物品种主要依赖进口，致使部分品种价格居高不下。面对这一境况，部分商家和多肉爱好者选择从境外购买多肉植物，进口量逐年增加。除正规途径进口外，私人夹带、非法邮寄入境的现象日益严重，口岸检疫风险逐年提高。目前国内对拟石莲属多肉植物的分类鉴定仍依赖形态学特征进行鉴定分类，但由于水分、温度等客观环境因素的变化，拟石莲属多肉植物的叶色、株高等外观特征会有十分明显的变化，给形态鉴定造成很大困扰，不利于口岸检疫人员进行分类鉴定。本研究利用 ITS 基因作为 DNA 条形码基因进行分子鉴定，利用其变异足够、易扩增且 DNA 片段相对较短的特点 [10]，建立拟石莲属多肉植物的精准分子分类鉴定新方法，可以消除由于外部环境变化导致植株外观形态变化给分类鉴定带来的困扰，为针对非法入境多肉植物进行快速准确的鉴定、归类提供可能。
多 篇 研 究 论 文 结 果 表 明， 除 ITS 基 因 外， matk6、ropB、rpoC1、rbcL、psbA-trnH 等基因可以作为备选基因进行植物条形码鉴定 [6,8]，本文作者也就这几个基因对拟石莲属多肉植物进行了研究。结果显示 matk6 基因扩增效率很低，不适合作为拟石莲属多肉植物条形码基因。另外 4 个基因 ropB、rpoC1、 rbcL 和 psbA-trnH 扩增和测序效率较好，但序列比对结果显示ropB、rbcL、rpoC1 3 个基因都非常保守，种内种间遗传变异无明显差异，不适合作为 DNA 条形码基因进行分析;psbA-trnH 遗传变异较大，但无法用这一个基因区分供试的 11 个物种。只有 ITS 基因种内种间遗传变异明显，有良好的种类区分效果，研究结果与本文作者对景天属多肉植物的研究结果一致 [8]。最终结果表明，几个备选基因中，只有 ITS 基因最适合作为条形码基因鉴定拟石莲属多肉植物，该基因可以准确区分供试样本各个物种，种内种间变异差异明显，且不同批次样本鉴定结果稳定。未来还需要进一步扩大样本量，对 ITS 基因作为 DNA 条形码基因的通用性进行进一步研究。
DNA 条形码技术通过分析植物特定基因的遗传变异信息对植物进行精准的物种鉴定，对复杂的隐存类群也有很好的分辨效果。目前有海量的植物 DNA 序列信息存储于 GeneBank 等数据库中，但有很多 DNA 序列欠缺具体的标本描述，甚至分类鉴定结果源于错误的形态学分类依据，因此 DNA 条形码技术在植物种类鉴定领域的应用受到制约。未来的研究需要在数据库中添加大量的模式植物及其衍生植物样本的基因序列，才能有效提高 DNA 条形码技术在植物物种鉴定领域的适用性和准确性。
4 结论
K2P 遗传距离结果证明，ITS 序列可以作为条形码基因对供试的 11 种多肉植物做快速分子鉴定。分析 ITS 构建的 NJ 树结果显示，ITS 序列对拟石莲属各种供试多肉植物有很好的聚类效果，ITS 可以作为供试 11 种拟石莲属多肉植物的 DNA 条形码序列。——论文作者：姜 一1 王仲敏1 刘 勇1 贺 艳1 高 建1 廖 芳1*
参考文献
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