摘要: 目的: 观察消炎退热合剂对脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 诱导的肺损伤模型小鼠肺组织中炎性因子表达的影响。方法: 取 ICR 小鼠，采用多次腹腔注射 LPS 建立小鼠肺损伤模型，随机分为模型组，地塞米松组( 2 mg·kg - 1 ) ，消炎退热合剂小剂量组( 3 g·kg - 1 ) 、中剂量组( 6 g·kg - 1 ) 、大剂量组( 12 g·kg - 1 ) 。各组灌胃给药，连续 4 周。末次给药后 2 h 采血，测定血清白细胞介素( interleukin，IL) - 4、IL - 12、IL - 10、干扰素 - γ( interferon - γ，IFN - γ) 、IL - 6、肿瘤坏死因子 - α( tumor necrosis factor，TNF - α) 水平; PBS 磷酸缓冲液进行肺灌洗，检测灌洗液中的 IL - 6 和 TNF - α 水平。取左肺组织，常规石蜡切片，HE 染色，光镜下观察肺组织病理学特征。结果: 消炎退热合剂中剂量组、大剂量组右上叶组织湿质量/干质量显著低于模型组( P < 0. 01) 。与模型组比较，消炎退热合剂小剂量组、中剂量组、大剂量组的 IL - 12、IFN - γ、 IL - 10 和 IL - 4 水平均显著降低( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 肺泡灌洗液中，消炎退热合剂小剂量组、中剂量组、大剂量组的 IL - 6 水平明显降低( P < 0. 01) ，消炎退热合剂大剂量组中 TNF - α 水平明显降低( P < 0. 05) 。HE 染色结果显示，与模型组比较，消炎退热合剂大剂量组小鼠肺泡间隔仅局部有轻度增厚，轻度炎细胞浸润，无出血。结论: 消炎退热合剂能有效降低 LPS 诱导的肺损伤模型小鼠的炎症水平。文献引用: 曹瑞，张军武，董冰，等. 消炎退热合剂对脂多糖致急性肺损伤模型小鼠炎症因子表达的影响[J]. 中医学报， 2020，35( 5) : 1055 - 1058.
关键词: 消炎退热合剂; 急性肺损伤; 白细胞介素; 干扰素 - γ; 肿瘤坏死因子 - α; 脂多糖; 小鼠
细菌感染引起的急性肺损伤( acute lung injury， ALI) 是临床上常见的危急重症之一，病 死 率 为 35% ～ 40%[1]。脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 可活化炎性细胞，释放大量炎性细胞因子[2]，导致肺泡内毛细血管膜损伤、肺泡表面活性物质功能失调及肺水肿[3]。在 ALI 发展过程中，有白细胞介素 - 1 ( interleukins - 1，IL - 1) 、IL - 6、IL - 10、IL - 12、肿瘤细胞因子( tumor necrosis factor，TNF - α) 、干扰素 - γ( interferon - γ，IFN - γ) 等多种细胞因子参与[4]。这些细胞因子作为信号分子在局部和全身水平进行引发、扩增和延续，在 ALI 的炎性级联反应中占据主导地位，因此，控制炎症反应是治疗 ALI 的关键[5]。根据临床表现，肺部感染属中医学暴喘、喘脱、温病等范畴，有痰热壅肺证、痰浊阻肺证、邪热闭窍证、肺热腑实证、气滞血瘀证等多种证候，表现为 “喘”“昏”“满”“热”并见，尤以上喘下满为多。消炎退热合剂由大青叶、蒲公英、紫花地丁和甘草 4 味中药组成，具有清热消毒，凉血消肿功效[6]，主要用于感冒发热，上呼吸道感染，咽喉肿痛及各种疮痈肿痛[7]。本研究采用多次腹腔注射 LPS 建立 ALI 小鼠模型，探讨消炎退热合剂抗 ALI 的药理作用及机制。
1 材料与方法
1. 1 药品与试剂 消炎退热合剂( 陕西中医药大学制药厂，批号: 18K06106) ; 醋酸地塞米松片( 新乡市常乐制药有限责任公司，批号: 1804176) ; 小鼠 IL - 4 试剂盒( 批号: EIA - 2018) 、IL - 12 试剂盒 ( 批号: EIA - 2544) 、IL - 10 试剂盒( 批号: EIA - 2012) 、IFN - γ 试剂盒( 批号: EIA - 2004) 、IL - 6 试剂盒( 批号: EIA - 2019) 、TNF - α 试剂盒( 批号: EIA - 2226) ，由艾莱萨生物科技有限公司提供。
1. 2 实验动物 ICR 小鼠，SPF 级，雌雄各半，质量为 18 ～ 22 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，合格证号: SCYK( 陕) 2017 - 003。饲养条件: 陕西中医药大学中药药理实验室( 国家中医药管理局中医药科研三级实验室) 饲养，室温 20 ～ 25 ℃，相对湿度 45% ～ 70% 。
1. 3 实验仪器 全波长酶标仪( UR1T - 660) 、微量移液器( 17120658) 、电子天平等。
1. 4 实验方法 取 ICR 小鼠 60 只，随机取 10 只作为正常组，其余分别参考文献方法[8-9]每 3 天腹腔注射 LPS 2 mg·kg - 1 1 次，连续 8 次后改为每天 1 次，持续 4 d，建立小鼠肺损伤模型。正常组小鼠腹腔注射等容积的生理盐水。在造模过程中，检测小鼠体温及一般体征，以体温上升为成模标准。将成模小鼠随机分为模型组、地塞米松组( 2 mg·kg - 1 ) 和消炎退热 合 剂 小 剂 量 组 ( 3 g · kg - 1 ) 、中 剂 量 组 ( 6 g·kg - 1 ) 、大剂量组( 12 g·kg - 1 ) 。各组每天灌胃给药 1 次，正常组、模型组小鼠给予等容积的生理盐水，连续 4 周。末次给药后 2 h，于小鼠眼球取血，分离血清，按照试剂盒说明书操作，采用酶联吸附法测定血清中 IL - 12、IFN - γ、IL - 4、IL - 10 的水平。处死动物，取小鼠肺右上叶称湿质量，置于 80 ℃ 恒温箱干燥至恒定，称质量，计算肺右上叶组织湿质量/干质量。用 PBS 进行肺泡灌洗，测定灌洗液中的 IL - 6、TNF - α 水平。摘取部分左肺组织，以 40 g·L - 1 多聚甲醛固定，常规切片，HE 染色，光镜下观察肺组织病理学改变。
1. 5 统计学方法 采用 SPSS 19. 0 统计软件进行数据分析。数据采用均数 ± 标准差( x珋± s) 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 t 检验。P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 各组小鼠肺右上叶湿质量/干质量比较 模型组小鼠肺右上叶湿质量/干质量明显高于正常组 ( P < 0. 01) ，消炎退热合剂中剂量组、大剂量组与模型组比较，湿质量/干质量显著降低( P < 0. 01) 。见表 1。
2. 2 各组小鼠血清 IL - 12、IFN - γ、IL - 4、IL - 10 水平比较 模型组小鼠血清 IL - 12、IFN - γ 明显高于正常组( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ，而 IL - 10 和 IL - 4 明显降低( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 与模型组比较，消炎退热合剂小剂量组、中剂量组、大剂量组的 IL - 12、IFN - γ 的水平均有不同程度地降低 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ，而 IL - 10、IL - 4 水平明显升高( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。见表 2。
2. 3 各组小鼠肺泡灌洗液中 IL - 6、TNF - α 水平比较 模型组小鼠肺泡灌洗液中 IL - 6、TNF - α 明显高于正常组( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 与模型组比较，消炎退热合剂小剂量组、中剂量组、大剂量组的 IL - 6 明显降低( P < 0. 01) ，消炎退热合剂大剂量组小鼠肺泡灌洗液中 TNF - α 明显降低( P < 0. 05) 。见表 3。
2. 4 各组小鼠肺组织病理学比较 肺组织镜下观察显示: 正常组小鼠肺泡结构完整，无出血、炎细胞浸润以及间隔增厚。模型组肺泡间隔增厚，间质有大量炎细胞浸润，伴随出血; 消炎退热合剂小剂量组肺泡间隔增厚，间质有轻度炎细胞浸润，伴随出血; 消炎退热合剂中剂量组肺泡间隔仅局部有轻度增厚，轻度炎细胞浸润，伴随出血; 消炎退热合剂大剂量组肺泡间隔仅局部有轻度增厚，轻度炎细胞浸润，无出血; 地塞米松组切片在镜下可见肺泡间隔仅局部有轻度增厚，轻度炎细胞浸润，轻度出血。见图 1。
3 讨论
AIL 发病机制比较复杂，病情发展迅速，且病死率高[10]。LPS 是革兰阴性细菌的主要致病成分，也是引起 AIL 并最终导致患者死亡的常见原因[11]。 AIL 以肺微血管通透性增高、肺泡腔渗出富含蛋白质的液体、肺水肿及透明膜的形成，并且伴有肺间质纤维化为主要的病理特征[12]，临床上表现为进行性加重的呼吸困难和顽固性低氧血症，影像学上表现为双肺渗出性病变[13]。LPS 可导致肺泡毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺间质水肿，其本质是肺部各种炎性细胞聚集激活浸润和大量炎性介质的释 放，形成肺损伤[14]。研究发现，肺泡巨噬细胞是多种炎症细胞因子的主要来源，在肺泡腔中，肺泡巨噬细胞分泌细胞因子，这些炎性细胞因子主要有 IL - 1、6、8、12、IFN - γ 和 TNF - α [15]，其主要作用是局部刺激嗜中性粒细胞趋化并激活。其中 TNF - α 是人体内主要的促炎和免疫调节因子，同时参与介导 ALI 过程。TNF - α 能促进血管内皮细胞黏附分子的表达，刺激肺内皮细胞、巨噬细胞的活化和迁移，并通过诱导细胞因子的分泌引发炎症反应。IFN - γ 可以介导许多与肺脏生理有关的前炎性反应; 诱导巨噬细胞产生 IL - 1、TNF - α、IL - 6 和 IL - 8 等; 具有促炎症反应的作用[16]。ALI 是多种炎症介质反应及相互作用的结果，促炎因子与抗炎因子之间的动态平衡是影响 ALI 的重要因素。然而，细胞因子之间的相互作用极其复杂，并且细胞因子之间并非各自孤立，它们之间相互联系，相互影响形成细胞因子网络，相互制约，一旦这个动态平衡被打破，则可发生细胞因子或炎性介质失控性释放，导致肺组织及全身靶器官组织损伤，导致 ALI 发生与发展[17]。
消炎退热合剂由大青叶、蒲公英、紫花地丁、甘草组成。其中，大青叶清热解毒、凉血消斑，是凉血解毒之要药[18]; 紫花地丁味苦性寒，有清热解毒、消肿散结之功，历来为治疗红肿、热痛之常用药，主治黄疸内热、痈疽恶疮、痈疽发背、疔疮肿毒、喉痹肿痛等[19]; 蒲公英清热解毒、利尿散结，主治感冒发热、扁桃体炎、急性咽喉炎、急性支气管炎等; 蒲公英和紫花地丁二者配伍，可达清热、散火、解毒、消肿之目的[20]; 甘草性平味甘，具有补中益气、润肺止咳、清热解毒、缓急止痛、调和诸药之功[21]。诸药配伍，共奏清热解毒、凉血消肿、抗炎之功，主要用于感冒发热、上呼吸道感染、咽喉肿痛及各种疮痈肿痛。本研究发现，消炎退热合剂小剂量组、中剂量组、大剂量组能不同程度降低 LPS 诱导的小鼠血清中 IL - 12、 IFN - γ 水平，并升高抗炎因子 IL - 10 和 IL - 4 水平; 使小鼠肺泡灌洗液中的致炎细胞因子 IL - 6 明显降低，消炎退热合剂大剂量组 TNF - α 水平明显降低。HE 染色结果显示，消炎退热合剂组大剂量组可保护小鼠肺组织，减轻肺泡间隔增厚，炎细胞浸润等现象。
综上，消炎退热合剂对小鼠的肺炎有一定的治疗效果，为其治疗呼吸道感染性疾病的进一步研究提供实验依据。——论文作者：曹瑞1 ，张军武2 ，董冰1 ，王兴海2 ，樊修和2 ，刘继平1 ，贺磊2
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