摘要：PVC(聚氯乙烯)塑料是世界第三大合成聚合塑料，对其进行无害化处理一直是一项难题。为研究黄粉虫取食PVC塑料膜对其生长发育的影响并探究其肠道中对PVC降解起关键作用的微生物，以PVC塑料喂食黄粉虫，每三天记录存活的黄粉虫数量、PVC膜重量和黄粉虫净重，60天后取肠道内容物对16SrRNA基因进行PCR扩增和高通量测序，分析肠道菌群结构变化。研究发现PVC组黄粉虫可正常生长，PVC膜失重率达到41.6%，但存活率、化蛹率和体重增长率显著低于麦麸组。属水平上，PVC组中优势菌种为Spiroplasma(74.44%)、Bacteroides(1.61%)、Escherichia-Shigella(1.18%)和Enterococcus(1.16%)。结果表明，黄粉虫可通过取食PVC膜获取能量，但尚不能完全满足其生长发育需要，其肠道菌群结构发生明显变化，为今后进一步研究多菌种协同降解PVC塑料奠定了基础。
关键词：环境工程学;黄粉虫;生物降解;聚氯乙烯;肠道微生物;多样性
聚氯乙烯(PVC)为世界上第三大合成聚合塑料，且难以被生物所降解[1]，填埋和焚烧是目前塑料废物的主要处理方式[2]，但均会不同程度的对环境造成二次污染[3-4]，对其进行无害化处理一直是一项难题。生物处理技术是通过生物代谢过程将废物转化成二氧化碳、水和生物质等最终产物进入地球化学循环中，具有降解高效和成本经济的特点，被认为是处理白色污染最具持续性的处理方式[5]。
肠道微生物是丰富的微生物资源库，目前昆虫肠道微生物正成为塑料降解菌株的重要来源[6-8]。黄粉虫(Tenebriomolitor)俗称面包虫，全变态发育，幼虫体长28mm−32mm，现已被人工大量饲养用作特种养殖。2011年，沈叶红[9]最先对黄粉虫幼虫啮食聚苯乙烯的现象进行了研究，并从肠道中分离出8株菌，但这8株菌并不能单独降解聚苯乙烯。2015年，Yang等[10]首次证实黄粉虫幼虫能啮食并消化聚苯乙烯泡沫塑料，并在幼虫肠道中分离出一株微小杆菌YT2(Exiguobacteriumsp.YT2)，该菌在液体培养60d的条件下，能够降解7.4%±0.4%的聚苯乙烯。2020年，PengBoyu等[11-12]最先证实黄粉虫幼虫是通过其肠道微生物的作用对PVC进行降解。昆虫肠道中的微生物对食物的降解往往是一个多菌种协同降解的过程[13]，且对于难降解有机物多菌种协同往往能获得比单一菌种更好的降解效果[14]。纵观已有研究，虽然证实了黄粉虫肠道微生物在降解塑料过程中的重要作用，但对于这一过程中哪些微生物可能参与其中并未深入研究。
鉴于此，本文从黄粉虫取食PVC塑料这一现象出发，研究黄粉虫取食PVC塑料膜后对其生长发育和肠道微生物菌群结构的影响，找出其中的差异微生物，为将来利用多菌种协同降解塑料做初步探索。
1试验部分
1.1试验材料
试验用黄粉虫购于南昌千花伴花鸟市场。
1.2主要试剂和仪器
PVC(聚氯乙烯)膜：临沂市奔多包装有限公司;RAeasyMiniKit(50)DNA提取试剂盒：QIAGEN;203443TaqDNA聚合酶：QIAGEN;T100PCR仪：Bio-rad;EPS-600电泳仪：Tanon;3500凝胶成像仪：Tanon;Novaseq测序仪，illumina;5810R台式高速离心机，Eppendorf;QIAxtractor高通量核酸纯化工作站，QIAGEN;2100Bioanalyzer生物芯片分析系统，Aglient;NanoDrop2000c微量分光光度计，ThermoFisher。
1.3试验方法
1.3.1黄粉虫的饲养
随机挑选体长在2cm左右的黄粉虫30条，置于90mm玻璃培养皿中，在室温(25±2)℃下培养，试验开始前，先用麦麸饲养3天，之后将培养皿清扫干净，用PVC塑料膜作为唯一食物，每隔5天喷洒无菌水补充水分，另外以喂食麦麸的黄粉虫作为对照，每组设置3个重复。每天及时清理死亡的黄粉虫尸体，每3天记录一次存活的黄粉虫数量、PVC膜重量和黄粉虫净重。
1.3.2肠道内容物的提取
饲养60天后，从麦麸组和PVC组中随机挑选15只黄粉虫，过95%酒精后点燃表皮进行灭菌。用无菌镊子夹住黄粉虫尾部与第二对足部以上部分，拖拉取出完整肠道，同组16只黄粉虫的肠道混合作为1个样本收集在无菌离心管中，于80℃冰箱中保存。
1.3.3样本基因组DNA的提取、PCR扩增与高通量测序
采用DNeasyPowerSoilKitDNA提取试剂盒抽提样本总DNA寄送至上海欧易生物医学科技有限公司进行后续PCR扩增及测序工作。以带barcode的通用引物:343F-5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'(前端);798R-5'-AGGGTATCTAATCCT-3'(后端)扩增各样本总DNA上16SrRNA基因的V3–V4高变区序列。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样后进行测序。
1.3.4测序数据分析
测序基于illuminaNovaseq平台，先后利用Trimmomatic(version0.35)软件、Flash(version1.2.11)[15]软件、QIIME中的split_libraries(version1.8.0)[16]软件和UCHIME(version2.4.2)[17]软件对原始数据进行质控处理，去除不合格的碱基，按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(optionaltaxonomicunit,OTU)聚类，选取每个OTU中丰度最高的序列为代表序列。采用RDPclassifierNaiveBayesian分类算法[18]对获得的OTU代表序列作分类学分析(置信度阈值为0.8)，选用Silva数据库进行物种比对注释。为消除因测序深度不同所引起样本间的多样性评估偏差，将各样品所测得的有效序列数抽平(均一化)处理后再进行后续分析。基于OTU数据计算各样品中细菌群落的多样性指数，并采用基于BrayCurtis距离矩阵算法比较各样品间细菌类群的组成差异。
2结果与讨论
2.1黄粉虫对PVC塑料膜的消化降解
试验过程中观察到黄粉虫可取食PVC塑料膜，见图1，被取食后的PVC膜周边呈现明显的不规则形状，见图2。膜重量从初始的0.1136g减少到0.0663g，18天失重率达到41.6%，减重明显，见图3。在前3天，PVC膜重量减少较快，第3天时失重率达到10.2%，之后PVC膜重量仍在减少，但减少的速度有所放缓，第15天时，减少的速度又有所上升，第18天时，失重率达到47.4%。
2.2取食PVC膜对黄粉虫生长发育的影响
黄粉虫单体平均体重在整个试验过程中是增加的，见图4(a)，但该过程分为3个阶段，在开始的6天里，单体平均体重呈现增长态势，但增长率显著小于对照组;第6天至第15天，单体平均体重有所下降;第15天开始又恢复增长，但增长速度明显下降。通过对PVC失重率的变化和黄粉虫单体平均体重的变化进行分析，我们发现两者呈一定的相关性，其原因可能在于开始的6天里，黄粉虫体内辅助PVC膜塑料降解的营养元素较为充足，因此能大量取食PVC塑料并转化为自己的身体重量，随着营养元素的消耗，PVC膜的摄取量开始减少，黄粉虫体重也随之下降，之后，黄粉虫肠道内微生物适应了以PVC膜作为单一营养来源，黄粉虫体重开始缓慢增长。虽然PVC组单体重量在试验过程中是增长的(18天增长率30.8%)，但其增长幅度远小于对照组(18天增长率75.7%)，从图4(b)、图4(c)可以看出存活率(83.3%)、化蛹率(0%)也显著小于对照组(存活率97.2%，化蛹率19.4%)，这可能是与麦麸相比，PVC膜所提供的能量与营养并不充分。
2.3取食PVC膜对黄粉虫肠道微生物多样性的影响
2.3.1肠道微生物α多样性变化
项目2组(8个)样本，得到validtags(即最终用于分析的数据)数据量分布在74018~88499之间，组间(克隆)文库的平均覆盖率为99.66%−99.72%(表1)，同时，稀释曲线趋于平缓，见图5，这表明样本测序数据量趋于饱和，各组所测得的数据能真实反映样本中绝大多数细菌类群的组成情况。
相关期刊推荐：《安全与环境学报》双月刊，主要刊载石油、化工、生态、环境、矿业、信息、网络、冶金、建筑、交通、勘探、国防等领域的相关论文。设有：环境化学、污染控制技术与原理、区域环境与生态、环境监测、废物处理与资源化、安全原理、安全工程、公共安全等栏目。
将所有样本测得的有效序列抽平处理后，得到的OTU总数为2196个，其中PVC组样品所测得的OTU数为1787个，对照组样品所测得的OTU数为1279个，两组共有的OTU数为870个，见图6。这说明两组样品所检测到的细菌类群在OTU水平上存在差异。α多样性分析结果表明：PVC组中细菌群落的丰富度(以Chao1指数来衡量，PVC组Chao1=1066.79±45.10，麦麸组Chao1=898.67±53.09)高于对照组，但其细菌群落的多样性(以Shannon指数“H”与Simpson指数“C”来衡量，PVC组H=2.11±0.30，C=0.33±0.05;麦麸组H=3.59±0.09，C=0.85±0.02)却明显低于对照组，见表1。这表明，PVC塑料可能诱导了黄粉虫肠道中一些与PVC降解相关的微生物的繁殖，由于PVC结构的复杂性，这些微生物可能只是参与了其中的一个步骤，且数量不是很多，与此同时，与PVC塑料降解过程无关的微生物逐渐减少，导致多样性指数降低。
2.3.2肠道微生物β多样性变化
为进一步了解取食PVC塑料和取食麦麸两组黄粉虫肠道菌群结构差异，在OTU水平上，基于样本间相似性距离，对所有样本进行二维主坐标分析(PCoA分析)，PVC组样本和对照组样本距离较远，说明其微生物群落组成存在差异，见图7。进一步，采用Bray-curtis和Binary-jaccard两种距离矩阵进行Adonis(多元方差)分析，以检验分组差异是否显著，R2越大说明该分组方案对差异的解释度越高，Pr小于0.05时说明本次检验的可信度高。在采用Bray-curtis距离矩阵，即只考虑物种丰度时，R2=0.562，P=0.025;在采用Binary-jaccard距离矩阵，即只考虑物种是否存在时，R2=0.209，P=0.030，见表2。可见，无论是仅考虑物种丰度还是仅考虑物种是否存在时，两组肠道菌群均有显著差异，差异具有统计学意义。说明黄粉虫取食PVC塑料后，肠道菌群发生了显著改变。
2.3.3肠道微生物群落组成变化
昆虫肠道中栖息的微生物群体数量极其庞大，它们协助宿主对食物进行消化[19-23]。昆虫的肠道微生物群落具有种内和种间水平上的高度差异性和类群多样性[24]。在门水平上PVC组中优势菌种依次为软壁菌门(Tenericutes，丰度74.46%)、变形菌门(Proteobacteria，丰度9.39%)硬壁菌门(Firmicutes，丰度8.69%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，丰度5.90%);对照组中优势菌种为硬壁菌门(Firmicutes，丰度51.37%)、变形菌门(Proteobacteria，丰度39.40%)、软壁菌门(Tenericutes，丰度8.06%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，丰度0.76%)，见图9。在属水平上，PVC组中优势菌种依次为螺原体(Spiroplasma，丰度74.44%)、拟杆菌(Bacteroides，丰度1.61%)、大肠杆菌志贺氏菌(Escherichia-Shigella，丰度1.18%)和肠球菌(Enterococcus，丰度1.16%)，麦麸组中优势菌种为乳球菌(Lactococcus，丰度15.28%)、梭状芽孢杆菌(Clostridium_sensu_stricto_6，丰度11.87%)、魏斯氏菌(Weissella，丰度10.47%)和螺原体(Spiroplasma，丰度8.06%)，见图8。由此可以看出，两组样本菌群结构明显不同。之前有研究表明，取食PE的昆虫肠道内的高丰度菌群主要是Sebaldellatermitidis，Brevibacteriumsp.，取食PS的昆虫肠道内的高丰度菌群主要是Alcaligenes，Brevundimonas，Myroides，Listeriasp.，Nitrospiradefluvii，Pedomicrobiumsp.，Aquihabitanssp.，unclassfiedXanthomonadaceae，unclassifiedSaprospiraceae，unclassifiedBurkholeriales[25-26]。本研究发现，取食PVC塑料的黄粉虫肠道菌群结构与取食PE和PS的肠道菌群结构不同，这可能是由于不同塑料的分子结构不同造成参与降解的菌种不同所致。
2.3.4肠道菌群差异物种分析
由于群落组成分析侧重于高丰度物种的变化趋势，但是有些物种虽然丰度较低，但是组间差异较大，通过LEfSe分析可以兼顾组间存在差异的高峰度物种和低丰度物种，找出组间差异指示物种。通过对PVC组和对照组内样品进行LEfSe分析，在属水平上发现了两组中分别对肠道菌群结构差异性影响较大的微生物。图9中显示了PVC组和对照组内的样本基于LDA分值分析得到的柱状图，柱状图中展示了两个组别中分别对菌群结构差异贡献较大的标志性微生物，可以看到PVC组中对菌群结构差异影响较大的优势菌为Spiroplasma、Bacteroides、Faecalibacterium和Comamonas，而对照组中的优势菌为Lactococcus、Weissella、Staphylococcus和Pediococcus。螺原体(Spiroplasma)作为昆虫肠道内常见的微生物[27]，目前尚未有螺原体参与塑料降解的报道，但有研究表明，昆虫肠道内的螺原体具有合成能源物质乙酸的及抵御外来细菌入侵的作用。如Leaderbetter等从低等白蚁肠道内分离到密螺原体属的三种螺原体ZAS-1、ZAS-2和ZAS-9，并且证明ZAS-1和ZAS-2具有还原产乙酸的功能[28]。VeiverPC，O'BrienRW，StaytorM等通过给白蚁喂食甲硝基羟己唑(灭滴灵)或把它们培养于纯氧条件下消除肠道中的螺原体，白蚁存活时间明显缩短，并且肠道中有非土著细菌的入侵[29]，因此在本研究中螺原体是直接参与了PVC塑料的降解过程还是通过内共生体的相互作用使得取食PVC塑料的黄粉虫具有了利用营养匮乏食物资源、抵御外来入侵、提高繁殖的能力还有待进一步研究。Zhang等对新疆棉田采集的微塑料进行了分析，发现塑料碎片表面富集了一些降解聚乙烯的类群，其中就包含了Bacteroides，并认为微塑料上微生物之间的生物相互作用中，酸杆菌(Acidobacteria)、厚壁菌门(Gemmatimonadetes)和拟杆菌(Bacteroidetes)是最重要的物种[30]。王玉军等，从施用过五氯硝基苯(PCNB)的土壤中分离得到1株高效菌株-吉氏拟杆菌(Bacteroidesdistasonis)，并对生长条件和降解机理进行了初步研究，结果表明该菌依靠共代谢作用还原PCNB，在培养液和土悬液条件下均能加速PCNB的降解[31]。李湛江等，从一些下水道底泥中筛选分离、驯化得到2株厌氧降解硝基苯高效菌吉氏拟杆菌(Bacteroidesdistasonis)和屎拟杆菌(Bacteroidesmerdae)，能与葡萄糖共代谢还原硝基苯，该菌最大降解硝基苯的速率为95mg/(L·d)[32]。以上研究成果说明PVC组中的拟杆菌(Bacteroidetes)对PVC塑料有一定的降解潜力。在本研究中，Comamonas仅从丰度上来看在PVC组不高，只有0.395%，但其对PVC组的菌群结构差异贡献较大，而在对照组中丰度极低，仅为0.0131%，已有的研究表明该菌可降解多种石油污染物，如催明超等研究了睾丸酮丛毛单胞菌Q10对喹啉类化合物的降解，发现喹啉和3-甲基喹啉不仅能有效地被降解,而且细菌也有明显的生长[33]。张立志等自大连某污水处理厂活性污泥中分离菌株Comamonassp.Z1，36h内能将25-75mg/L邻甲酚、25-200mg/L对甲酚完全降解[34]。OkaiM等从日本川崎港某公园的底泥水中分离出了一种降解5环多环芳烃二苯并蒽(DBA)的Comamonassp.该菌在7d内降解了DBA(30μg/ml)的29%，该菌株还能降解芘(Pyr)、苯并[b]荧蒽(BbF)、苯并[k]荧蒽(BkF)和苯并[g,h,i]苝(BghiP)分别40、14、15和19%[35]。此外，Comamonas还对2-吡啶甲酸[36]、阿特拉津[37]、活性偶氮染料[38]等具有良好的降解能力。因此，该菌很可能也是重要的PVC降解菌。综合上述研究成果，Spiroplasma、Bacteroidetes和Comamonas很可能都参与了PVC的降解过程，这符合在自然环境中，复杂、难降解有机物的降解过程往往是由多个菌种协同代谢完成的这一特点[39]，但以上几种微生物具体参与了PVC降解过程中哪一步，以及它们之间在代谢路径上存在怎样的相互关联，未来还需要进一步做深入研究。
3结论
(1)黄粉虫可取食PVC塑料膜并从中获取一定的能量，PVC膜重量从初始的0.1136g减少到0.0663g，18天失重率达到41.6%，虫体平均体重增长率为30.8%，存活率为83.3%,化蛹率为0%。
(2)黄粉虫取食PVC膜后，其肠道微生物多样性显著降低，Shannon指数与Simpson指数分别由对照组的3.59±0.09和0.85±0.02降低至2.11±0.30和0.33±0.05。
(3)取食PVC塑料后黄粉虫肠道中原有的菌群结构发生显著改变。在属水平上，取食PVC塑料的黄粉虫肠道中的优势菌种为Spiroplasma(74.44%)、Bacteroides(1.61%)、Escherichia-Shigella(1.18%)和Enterococcus(1.16%)，对肠道菌群结构差异影响较大的菌种为Spiroplasma、Bacteroides、Faecalibacterium和Comamonas，这为今后进一步研究多菌种协同降解PVC塑料奠定了基础。——论文作者：徐健全1*，杨爱玉1，欧阳勇1，张燕1，胡文静1，曾建立2
