[摘要]辅助生殖技术(ART)领域进展迅速，由于临床实践中操作步骤繁琐，如分选精子，卵母细胞的选择，体外受精，胚胎培养，胚胎的监测等，所以在效率和临床决策方面仍有进一步改进的需求。微流控技术既是技术手段也是一门科学，它是在亚微升水平研究流体的行为特征。其检测系统管道及检测终端具有极大灵活性，可适用于不同的检测目的，其检测精度高的同时节省样本量，具有高度集成性特征，与辅助生殖实践中的检测需求相匹配。应用微流控技术可以评估精子，卵母细胞和植入前胚胎结构功能和环境等基本生物学信息，并据此给予准确有效的应对方案和临床决策。基于上述内容，本文中我们就微流控技术在辅助生殖上的应用作一综述，以期推进微流控技术在生殖领域的应用和完善。
[关键词]辅助生殖技术;卵母细胞;胚胎;分选;微流控
微流控(microfluidics)是指通过数十到数百微米微管道精确操控微尺度流体的一门科学和技术，是一门涉及物理、化学、微电子、材料和生物医学等众多领域的交叉新兴学科[1]。微流控将常规生物化学实验的基本功能缩小到几平方厘米芯片之上，具有微型化、集成化特征。其最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成，使用非常少的样本和试剂做出高精度和高敏感度的分离和检测，费用低，分析用时短[2]，见图1。微流控技术广泛应用于细胞生物学、化学、遗传学及分子生物学等领域，并开始在实验室检测和临床治疗等医学领域中崭露头角。人类辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology，ART)虽然取得了长足的发展，但是其效率仍然较低，因此，人们在不断寻求新的技术手段以改善结果和提高效率。此外，辅助生殖技术由于脱离了自然选择和体内生殖道环境，影响植入前胚胎的质量和怀孕率，可能通过表观遗传机制影响下一代的健康。因此，寻求新技术对辅助生殖流程进行优化更加迫切[3]。基于微流控技术自身优势将其应用于辅助生殖领域，将对推动辅助生殖技术发展起到重大的作用，并有可能彻底改变辅助生殖过程[4]。目前，微流控技术在ART中的应用和研究主要集中在胚胎培养上，随着微流控技术自身的发展和完善，也逐步应用于辅助生殖实验室配子和胚胎操作的各个环节。在本综述中，我们将总结近年来微流控技术在配子筛选，卵母细胞成熟和胚胎培养等生殖领域中的应用，并对其发展趋势进行展望。
1.微流控技术与雄性生殖细胞
1.1微流控精液分析:目前，男科临床上通过1个或多个参数来评估精子质量，这些参数包括精液的液化时间，pH值、精子浓度、活力、形态和DNA完整性，以及精浆果糖等[5]。这些分析技术难度大，劳动强度高，主观影响大，人员需要专门培训。此外，即使是先进的计算机辅助系统(例如ComputeraidedSemenAnalysisSystem，CASA)也需要手动稀释和混匀。操作简便，检测迅速，分析准确的精液分析技术的开发具有重大的现实意义。这些改变发生在2010年，Segerink等[6]研发出了一种芯片，它可以计算男性精子浓度，并衡量其流动性，该技术采用电极片进行电流的感应，在精子细胞通过时，电阻发生短暂变动可以测出精子浓度，同时，基于电阻抗的差异可以将精子、白细胞和其他细胞区分开。2017年Schaff等[7]基于微流控平台开发出一种小型的离心装置，这种便携式的男性生育能力检测仪可以让男性在家自行进行精液质量定期监测。随后Kanakasabapathy等[8]将智能手机与微流控检测平台相结合最终直接将检测结果发送到智能手机，通过与实验室的精液分析仪进行比较，其准确性为98%，从而成为家庭的即时诊断工具。最近，Zhou等[9]总结了近些年微流控技术在精液检测方面的相关研究进展。
1.2微流控精子分选:在体外受精(invitrofertilization，IVF)中，通常要根据精液特征(如精液量、精子浓度及精子活力等)采用适当的方式将精子分离，从而进行体外受精或者卵胞质内单精子注射(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)和供精者精液授精(artificialinseminationwithdonor’ssemen，AID)。传统的处理方法一般是将精液简单地培养洗涤，分离出精子进行后续操作。这种方法耗时、耗力，并且会带来精子损伤，例如，离心过程中精子DNA的断裂。实际上，微流控芯片在生殖医学领域最初也是用于精液检测。Kricka等[10]在20世纪90年代用钠钙玻璃和硅做材料制造的微管道设备，通过计算精子游动10mm所用的时间来测算精子数量和活力。在2003年Cho[11]和Schuster[12]等通过基于微流体和含有黏弹性介质的微通道对精子进行分离，这是因为活力较好的精子具有较高的扩散率，跨越层流线从而实现无离心的精子分离。这种方法不仅有效地减少了离心过程中损伤精子DNA产生的负面影响，同时大大提高了分离效率。基本实现了简单、快速、低损伤的精子处理原则，但是该方法由于制作工艺和微流体流速的限制还不能大量应用于临床。在2014年Nosrati等[13]提出了一种临床上可应用的微流体装置，该装置基于500个平行微通道中的进行性运动来选择精子。20min内可以从1ml精液中纯化出精子活力良好且DNA完整的精子。公牛精子的实验表明，所选精子活力提高了89%以上，人类精子临床测试显示，人类DNA完整性提高了80%以上。Knowlton等[14]通过综述总结了近几十年微流控技术在精子的形态、活力、DNA完整性等方面对精子进行筛选检测，以及其在人类和动物研究上的进展。微流控技术自身的完善以及联合其他分析技术将会在精子分选的检测中发挥更高的效能。
2.微流控技术与雌性生殖细胞
2.1微流控卵母细胞分选:正常成年男性每天都可以产生大量的精子，然而卵子的数量从一出生就已经决定。临床上，通过激素促排卵，在较好的情况下每次可以获取10枚左右的卵子，加之每个周期都很长，患者压力也很大，因此，选择好的卵子和选择好的精子对于ART的成功同等重要。临床上对于卵子的选择通常是由专业胚胎操作师根据卵子成熟后的形态进行主观判断，既高度依赖人工，又忽略了卵子的发育过程，因此，很难对卵子质量进行全面评估。而现有的实时成像监测装置造价昂贵，基于微流控平台可以对卵子筛选实现定量分析。Angione等[15]设计了一种微流控平台，可以及时观察和有效记录单个卵母细胞的发育情况和形态，这种微流控装置通过记录卵子的发育情况，即应用卵细胞膜的特性可对每个卵子进行仔细分析，精确地判断。Hwang等[16]开发了一种在电场条件下质量不同卵子移动速度不同的自动化分析平台，客观高效地对卵子的质量进行了分选和评估。Murayama等[17]设计了一种微机械感应器，通过感应卵子表面弹性用于卵子质量评估。此外，可以通过基因组学、分子生物等方法检测卵丘细胞中基因和蛋白的表达对卵子的状态进行评估和分析[18，19]。
2.2卵母细胞体外成熟:卵母细胞体外成熟是辅助生殖的基本技术之一，通常针对一些卵子成熟障碍的不孕患者，例如，多囊卵巢综合征、卵泡发育迟缓的患者[20]。与传统的静态培养方法相比较，增加微流体更利于卵母细胞的成熟。此外，通过辅助未成熟卵母细胞体外成熟培养技术可以避免卵巢过度刺激综合征的发生。但是，由于未成熟卵母细胞体外成熟培养技术的有限性，体外成熟的卵子质量相对体内较低，所幸的是微流控技术能够提高体外成熟卵子的质量。2001年Walters等[21]首先通过微流控装置实现了对猪卵母细胞的体外成熟培养，与传统的微滴法培养相比，微流控装置显著提高了猪卵母细胞的MII期卵子的成熟率。更具意义的是，微流控通道中卵母细胞卵丘细胞扩散减少了，即微流控通道能够改善猪卵母细胞的核成熟，但可能限制胞质成熟，这可能是因为微流体通道的物理空间大小限制了卵丘细胞的扩散。随后，Hester等[22]证实微流控培养的成熟卵子其受精能力也显著高于传统的微滴法。传统的卵母细胞成熟技术在卵子成熟以后需要通过机械法或者酶消化法去除卵丘细胞，操作过程比较繁琐，耗费时间，同时，这种操作可能会对胚胎的后续发育造成影响。目前，由微流控装置已经可以通过机械法和酶消化法实现对卵丘卵母细胞复合体的卵子的剥离。此外，微流控芯片可以连续实现对小鼠成熟卵子的卵丘细胞的自动化剥离，这种芯片大大简化了卵母细胞体外成熟的操作流程[23]。
3.微流控技术与体外授精
体外授精是ART中很重要的技术，将微流控平台用于体外受精最大的优势是可以实时观察，并且控制体外受精精子量。因为常规条件下过多的精子受精会导致多核胚胎的发生，导致胚胎染色体混乱，而精子数量过少则可能降低受精率。精子的活力，卵母细胞的质量以及流体运动都会影响微流控平台的受精结果。在体外受精中，如果精子浓度低，则将决定由ICSI进行授精，从而克服了精子浓度低导致受精率下降的问题。然而，由于使用ICSI技术具有机械侵入性，存在潜在的安全性问题，且该技术需要经验丰富的ICSI技术人员操作[24]。而微流控平台可以解决这一问题，是临床ICSI的潜在替代方法。例如，Suh等[25]发现，当精子浓度低至2×107/L，与标准孔培养皿相比，在微流体平台上的受精率明显更高，而传统的体外受精方式精液的浓度需要达到(0.5～1.0)×109/L。此外，将微流体IVF平台和卵母细胞分选平台相结合选择高质量精子和健康的卵母细胞进行受精，则可大大提高IVF受精质量。国内的Han等[26]报告了一种新型微孔结构的微流控装置，该装置集合单个卵母细胞的分选，受精和胚胎培养，实现了在微流体装置与传统方式一样的受精率，优势是此微流体装置可通过简化卵母细胞的处理和操作流程，实现了快速方便地更换培养基以及对单个卵子持续监测和分选。这些研究都显示了微流控芯片在体外受精研究中的优越性和潜在的应用前景。
4.微流控技术与胚胎
4.1胚胎分选:选择好的胚胎进行移植对于临床上能否正常妊娠显得极为重要，甄别胚胎好坏最常用的方法是通过显微镜进行形态学评分。临床上一般通过显微镜观察卵裂率，胚胎细胞数量，细胞破碎程度，囊胚形态等。然而，显微镜观察可能是主观的，缺乏预测价值，实验室内部和各个实验室之间都有差异，且无法对胚胎的整个培养过程进行持续监测。此外，反复的胚胎观察会影响后续胚胎发育。微流控装置为能够进行生化非侵入性分析和选择胚胎提供了一条新的途径。目前已经积累了大量用于胚胎生物标志物测量的数据，例如，氧代谢，氨基酸代谢和能量代谢等。O’Donovan等[27]开发并测试了一种呼吸微流控装置，可以监测2细胞小鼠胚胎的耗氧量，通过在1h时间内监视多达10个植入前胚胎，该生物芯片监测2细胞胚胎和植入前胚胎细胞的耗氧量，为胚胎的筛选和评估提供了一种非侵入性、简单且方便的方法。Urbanski等[28]通过设计微流控芯片，巧妙地通过微荧光酶分析法评估与胚胎发育相关的葡萄糖、丙酮酸和乳酸的消耗和产生情况，通过标准化自动化程序，检测了整个培养期间单个胚胎和单个细胞进行代谢的情况。Heo等[29]在单个集成设备上，设计了能够胚胎培养和对代谢产物进行自动分析的微流控芯片。尽管这些微流体胚胎测定法目前已用于小鼠胚胎，但尚未应用于人类胚胎，且微流控的设计和测定仍需要进一步完善。但是可以想象，基于微流控将胚胎培养和非侵入性的生物标志相结合用于胚胎筛选，将极大地提高移植胚胎质量和分选效率。
4.2胚胎培养:胚胎体外发育率很低的原因之一就是胚胎培养程序太多太复杂，期间各种胚胎操作的变化都会影响胚胎发育。近些年已经在精简胚胎操作程序以提高胚胎发育质量，但是由于体外培养环境与体内差异很大，胚胎发育质量仍然较差。微流控芯片微尺度的环境能够模拟正常生理状况的特点，决定了它用于胚胎培养的优势。Glasgow等[30]将小鼠受精卵在微管道中成功培养到2-细胞期。Wheeler等[31]通过微流控芯片对猪的4-细胞期胚胎进行体外培养得到囊胚，随后进行体外移植得到5只仔猪。Raty等[32]的研究指出，小鼠早期胚胎在微流控装置中培养后囊胚率显著高于微滴组。国内的王维等[33]模拟人体环境构建微流控芯片，通过对小鼠受精卵持续的灌注培养，结果证实，微流控动态法对4-细胞胚胎、桑椹胚和囊胚形成率均有显著提高。目前，通过微流控装置对胚胎培养的研究主要集中在动物上，但最近有报道，通过微流控装置对人类的冷冻胚胎进行了体外培养，但是结果并没有证实微流控能够提高后续胚胎发育质量[34]。由此看来，微流控平台能否提高人类胚胎发育质量需要更多地研究和实验证实。
4.3胚胎冷冻保存:哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻技术在过去几十年间取得了巨大的进步，然而，相比新鲜卵母细胞和胚胎，冷冻保存胚胎的发育成功率依旧很低[35]。目前胚胎冷冻保存技术广泛应用于慢性疾病，癌症治疗或者由于其他疾病将丧失生育能力的妇女[36，37]。胚胎冷冻保存分为两种，慢速冷冻和玻璃化冷冻，目前，玻璃化冷冻技术以其高达90%的成功率应用最为广泛，玻璃化冷冻面临的挑战主要来源于冷冻保护剂的渗透损伤、毒性损伤和冷冻过程中冰晶的形成。2011年Heo等[38]首先将微流控装置用于胚胎的冷冻保存。2015年Lai等[39]建立了一种自动化的微流控冷冻平台对大鼠的卵子和受精卵进行冷冻，结果显示，自动化的微流控冷冻平台显著改善了冷冻后卵子和胚胎的形态，有效提高了胚胎发育质量。Roy等[40]开发了一种微流控装置，这种微流控装置能够及时检测在加载不同的冷冻保护剂过程中单个小鼠卵母细胞的体积变化，这种微流控装置将对未来新的冷冻保护剂开发和改进原有的冷冻保存配方和程序起到极大的促进作用，并有望应用于人类辅助生殖中。国内的杨云等[41]制作了用于猪卵母细胞冷冻的微流控装置，提高了卵母细胞存活率及卵裂率。周新丽等[42]设计了用于添加-去除保护剂的微流控芯片，并首次与冷冻载体相结合，对猪卵母细胞进行冷冻保存研究，也取得了不错的效果。
5.微流控技术在生殖领域应用的未来
在过去的20年中，经过各行业人共同努力，使得微流控这一跨学科的技术在哺乳动物配子和胚胎的分离、分析和冷冻保存中取得了重大进展。但微流控技术的应用还局限在动物实验水平上，距离人类胚胎的广泛应用还有一段很长的路要走。同时，微流控芯片在辅助生殖上的应用还需要改进和优化。因为目前微流控技术在生殖领域的应用主要考虑的是其功能的完善和自动化操作上，其过程还相对复杂，且尚未考虑到临床应用的便捷性和使用成本。此外，微流控技术在人类胚胎上的实验计划空白，微流控技术到底能否改善ART结果还需要更多的动物实验和临床实验得以证实和填补。不过随着微流控芯片的进一步研究和优化，相信可以开发出更符合临床应用的微流控芯片。——论文作者：王中立1，2王琪3邓娟4雷兰杰4，5杨磊2，5*
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