摘要：微纳尺度物质的分离和分选在精准医学、材料科学和单细胞分析等研究中至关重要。精准、高效和快速的分离微纳尺度物质能够为癌症的早期诊断、生物样品检测和细胞筛选提供重要帮助，其中基于外加场分离技术的分离微纳尺度物质因可以对微纳尺度物质高效在线分离和分选，被广泛应用于微纳米颗粒、外泌体以及生物细胞的分离工作中，而目前多数外加场分离技术存在装备繁琐和样品消耗大等问题。微流控技术是一种通过制作微通道和微流控芯片操纵微小流体对微纳尺度样品组分进行分离的技术，因具有快速检测、高通量、在线分离、集成性高、成本低等优势现被应用于微纳尺度物质分离分析中，是一种微纳尺度物质分离的有效方法，通过在微流控芯片上设计不同的通道及外部配件提高主动场对微纳尺度物质分离效率。外加场分离技术与微流控技术联用可以实现微纳尺度物质的无损、高效、在线分离。该综述主要概述了近年来在微流控芯片上依托流动场、电场、磁场及声场等外加场分离技术来提高对微纳尺度物质分离效率的研究现状，并将各个外力场对单细胞、微颗粒等微纳尺度物质的分离进行分类介绍，总结各自的优缺点及发展应用，最后展望了外加场分离技术与微流控技术联用在应用于癌细胞的早期筛查、精确分离微尺度物质领域的未来发展前景，并提出联用技术的优势和未来应用等。
关键词：微流控;微纳尺度物质;主动场分离;综述
微纳尺度物质(尺寸分布为0
微流控技术(microfluidics)也被称为芯片实验室(labchip)，起源于1990年Manz等[16]提出的“微全分析系统”(miniaturizedtotalchemicalanal⁃ysissystems，μTAS)，指的是通过制作微管道(尺寸为数十到数百微米)或微流控芯片来操纵微小流体(体积为pL～μL)并对微尺度物质样品组分进行分离的技术，是一种主要针对微纳尺度物质分离的有效方法。微流控技术实现了对微纳尺度物质的精准、高通量、在线分离，可以用最少的试剂、时间和成本完成分离任务且具有微型化、集成化、成本低廉、高通量等特征[17，18]。随着微流控技术的发展，利用微纳尺度物质的不同性质，制作特殊结构的微流控芯片装置，以提高对微纳尺度物质的分离效率，更具有针对性，微流控芯片的生物相容性提高了其在生物细胞操作[19，20]和分析[21，22]中的应用，同时在微流控技术方面可以使复杂分析方案合理化，显著减少样品体积和试剂成本，在处理微量样品时具有降低成本、降低危害、提高分辨率等优势。随着微流控技术对微纳尺度物质分离发展的不断增长与进步，针对细胞、颗粒物等微纳尺度物质的分离在医疗领域[23-25]、生物化学领域[24，26-28]等起到了至关重要的作用。利用这些优势可以将基于外加场的分离技术与微流控技术进行联用，制备所需的微流控芯片[29]，针对不同特性的样品施加外部力场，比如电场[30，31]、磁场[32，33]及声场[11]等来对混合样品组分进行精准分离。
本文主要概述了在微流控芯片上依托流动场、电场、磁场及声场的主动分离技术来提高分离效率的研究现状，并探讨对生物细胞的富集与混合颗粒物的有效精准分离的发展与应用。
1流场场流分离技术
流场场流分离技术(flowfield⁃flowfractiona⁃tion，FIFFF)是各种场流分离技术中使用最通用的一种技术，其中非对称流场流分离技术(asymmetri⁃calflowfield⁃flowfractionation，AF4)是1987年由Wahlund和Giddings提出的一种流场分馏技术[34]，目前被广泛应用。该技术将非特异性的相互作用减少到最低限度，并具有分辨率高的优点[35，36]，在FIFFF通道内，外加力场为垂直于流道方向的横向流，样品在横向流的驱动下与自身扩散力之间达到一个平衡，各组分在通道内壁上产生分布差异，其中，小尺寸样品在积聚壁上形成的分布层要高于大尺寸颗粒，这时流动场在通道内流动时，分布层较高的小尺寸颗粒要比大尺寸颗粒更早的洗脱，从而实现分离[37]。FIFFF没有固定相，对样品施加的剪切力和机械应力较小，使它成为一种温和的分离技术，现已广泛应用于分离和表征不同尺寸和不同形状的颗粒、细胞、蛋白质或DNA等物质[38，39]。
Dou等[40]利用非对称流场流分离技术在线耦合紫外(ultravioletabsorptiondetecto，UV)、多角度光散射(multianglelightscattering，MALS)和荧光(fluorescence，FS)探测器对蛋黄血浆进行分离和表征。利用蛋黄血浆作为AF4的载体液，评价了AF4对蛋黄血浆中的可溶性蛋白、低密度脂蛋白(lowdensitylipoproteins，LDL)及其聚集物进行高效快速分离和表征的实用性。同时研究了低密度脂蛋白在卵黄血浆中的聚集行为，利用程序交叉流的AF4具有提高检测能力、降低样品消耗和减少分析时间等优点，、。结果证明，AF4适用于尺寸分布范围较大目标物的分离和表征，如蛋黄血浆。该团队还利用AF4结合多角度光散射和差分折射探测器(differentialrefractiveindex，DRI)对淀粉的分离和表征进行了深入研究[41]，为今后更好地研究淀粉结构⁃功能的关系提供重要信息。
Ashby等[42]利用流场场流分离技术结合离心分离技术，建立了一种基于相对解离率的冠状蛋白鉴定方法，用来筛选纳米颗粒和蛋白质之间的相互作用。该方法将超顺磁氧化铁纳米颗粒(super⁃paramagneticironoxidenanoparticles，SPION)和免疫球蛋白G(lgG)在人血清中进行孵育，再利用F4和离心法分离出与SPION亲和力较好的蛋白质，F4以较快的速度洗去与纳米颗粒相互作用的蛋白质，解决了当纳米粒子进入到生物基质时，基质表面形成的蛋白冠对纳米粒子在生物系统中的后续行为影响，有助于研究蛋白质冠的时间分布及其在生物基质中的演化，以及高通量分析蛋白质冠与粒子特性相关的动态特征。
Adkins等[43]将纳米颗粒跟踪技术(nanoparti⁃cletrackinganalysis，NTA)与AF4耦合得到AF4⁃NTA技术，弥补了NTA在线检测器存在检测范围窄、流量小和压力阈值低等问题。AF4⁃NTA作为一项对混合物中不同粒子数的纳米材料进行高效精确粒子计数的技术，利用合理的分流设计，对尺寸为50、100和200nm的聚苯乙烯混合物进行分离分析，同时在线对混合物中不同纳米尺寸目标物进行精确地颗粒计数。
目前，AF4在不断地进步与发展，无论在化学分离领域或者生命科学等其他重要领域都显示出了巨大的潜力，它可以利用温和分离且装置结构简单等特性，与不同的检测器进行耦合，为生物治疗和纳米颗粒分离表征提供技术支持。在未来，AF4温和分离特性优势与微流控的通道小型化、节约试剂和节约样品成本的优势相结合，成为一种高度灵活和具图1目前被广泛使用的4种电场分离技术Fig.1Fourwidelyusedelectricfieldseparationtechniquesa.capillaryelectrophoresis(CE);b.dielectrophoresis(DEP);c.electricalfieldflowfractionation(EIFFF);d.inducedchargedelectroosmosis(ICEO).EP：electrophoresis;EOF：electroosmoticflow.备高分辨率的分离技术，具有巨大的发展前景。
2基于外加电场的分离技术
近年来，越来越多的科学家利用电场对微纳尺度物质进行分离分析。主要分离原理是根据目标物尺寸、大小和带电荷量等特性的不同，通过调节电参数使其在分离系统内的运动行为发生变化，达到对生物细胞和颗粒物等微纳尺度物质的操纵与分离。常见的外加电场的分离方法分为4种(见图1)，分别为毛细管电泳[44]、介电泳(dielectrophoresis，DEP)[29，31]、电场场流分离[45-47]、电渗驱动[48]。
2.1毛细管电泳
根据在一定的电场作用下带电粒子在介质中定向迁移的性质，利用毛细管电泳技术在两端施加高压电场对微纳尺度物质的分离分析满足当今高效快速的分离需求[49-51]。毛细管内壁与缓冲溶液的界面上形成双电层，在高压电场的驱动下形成定向运动的电渗流。如图1a所示，带电粒子根据自身的电泳力和电渗流力差异实现分离[52]。毛细管电泳具有分析快速灵敏、样品消耗量少、分离效率高等优点，在药物分析、环境监测、食品检测中应用广泛[50，52-55]。
将毛细管电泳技术与微流控技术联用，即微流控芯片电泳(microchipelectrophoresis，MCE)是近年被广泛应用的一种新型分离技术，具有低成本、分辨率高、快速等优点[56，57]，被广泛用于微纳尺度物质的分离分析中。Zhang等[58]利用微流控芯片电泳技术对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种细菌进行定量检测，有助于对人工污染的生食肉类中的致病菌进行分析，结果显示MCE技术具有灵敏度高、速度快、试剂消耗少和操作迅速等优点，是一种有效、可靠的食品安全评价方法。
Jeon等[59]开发了一种基于压力驱动流诱导电泳的连续分离方法，如图2a所示，在微流控装置内，混合的微纳尺度物质受到来自流体的驱动力、电渗流带来的阻力和电泳力为主导的3种合力，根据其自身受电场影响下的电泳迁移率不同而进行有效分离，分离效率可达97%。图2基于微流控芯片电泳的分离系统
蔡绮丹等[60]为了验证阿霉素这一常用的蒽环类抗肿瘤药物是否与谷胱甘肽存在结合，利用微流控芯片电泳技术微型化集成化等优点。如图2b所示，利用简化的Hummel⁃Dreyer芯片毛细管电泳法，考察了阿霉素与还原性、氧化型谷胱甘肽的亲和作用，最终得到了谷胱甘肽自身与阿霉素无亲和作用这一结论，为抗肿瘤药物的研发提供了理论支持。综上所述，毛细管电泳技术与微流控技术的联用在医疗、食品和生物等各个领域都有很大的发展前景。毛细管电泳技术与微流控技术的联用同时具备毛细管电泳技术无标记和对细胞等无损伤的优势，联用微流控技术的高效、微型化精准分离，解决了传统毛细管电泳技术装置繁琐等问题，具有广阔的应用前景。
2.2介电泳
介电泳由Pohl[61]在20世纪50年代首次研究提出，指可极化粒子在非匀强电场中将会受到极化作用进而产生偶极矩，偶极矩与非匀强电场之间产生介电泳力。粒子在该体系内将会受到指向场最大的力正介电泳力(positivedielectrophoresis，pDEP)，或者远离场的最大力负介电泳力(negativedielectrophoresis，nDEP)，如图1b所示。介电泳操纵粒子具有集成化、操作方便、成本低廉等优势，已广泛用于分离微颗粒和细胞[62-65]。但是介电泳如果在强电场条件下对生物样品进行分离，则会导致生物样品在电场内受焦耳热的影响直接死亡或产生不可逆的损伤[65]。因此，利用微流控装置产热少、高通量和成本低等优势，将介电泳技术与微流控技术联用，可以实现对生物样品无损和高效的分离[31]。
为了解决多组分样品的同时富集，Zhao等[66]研制了一种新型微流控装置，在直流介电泳(directcurrent⁃DEP，DC⁃DEP)提供的非匀强电场条件下，调节外加电场的电参数和流动相悬浮液的电导率，实现对大小相近但介电特性不同的微纳米混合颗粒物的分离。
Zhao等[67]还制作了新型交流介电泳(alterna⁃tingcurrent⁃DEP，AC⁃DEP)微流控芯片，芯片同时将两个电极嵌在相对侧壁上的一组不对称孔内，使产生不均匀的电场。如图3a所示，生物细胞等样品通过微流控装置内时，利用液聚焦使样品在同一水平线移动，聚焦后的样品进入到DEP电场范围内时，样品受pDEP和nDEP的影响分别向两侧孔内移动。该实验研究了活酵母细胞和死酵母细胞在不同离子浓度、电导率、交流电场频率下的DEP行为。与直流介电泳不同的是，该装置利用调节交流电频率、电压等参数，成功分离大小相近但介电常数不同的活酵母细胞和死酵母细胞。该微流控装置制作简单，设计可以避免焦耳热效应，且能诱导非均匀电场产生强梯度，可用于分离尺寸相近的纳米颗粒。等[68]使用独特的合成介电泳标记来明确多种细胞类型，在微流控装置的内部通道结构上放置两个具有不同角度的倾斜电极，利用倾斜电极提供非均匀电场，如图3b所示。在非匀强电场下，混合样品中不同尺寸的颗粒物在装置内产生的运动行为不同，实现了高分辨率和高吞吐量的分离效果。
Khoshmanesh等[69]设计了一种非黏附的脂质捕获DEP系统，如图3c所示，利用光刻技术在玻璃基板上制备了DEP微电极阵列，避免了生物细胞的污染。基于芯片的阵列应用于捕获人白血病细胞的环境扫描电子显微镜(environmentalscanningelec⁃tronmicroscope，ESEM)分析。这项工作验证了DEP细胞保留和捕获技术。利用DEP芯片对人白血病细胞进行捕获，同时在ESEM上对单个非贴壁细胞进行高分辨率分析，达到了造血肿瘤和干细胞的水动力捕获和长期动态分析。
Sun等[70]开发了一个具有自组装液体电极的新型DEP微流控装置，如图3d所示。利用室温离子液体形成的液体电极与DEP缓冲溶液耦合，再利用外部电场所施加的电压，提高微流控芯片内的电导率，产生电场梯度以对芯片内的细胞与粒子进行高效分离，利用自组装的液体电极DEP微流控装置成功分离聚苯乙烯珠与PC⁃3细胞、存活与凋亡的PC⁃3细胞以及人脂肪干细胞(adipose⁃derivedstemcells，ADSCs)与MDA⁃MB⁃231癌细胞。该装置具有成本低、分离效率高等优点，在细胞分离实验中具有巨大潜力。
Khamenehfar等[71]利用介电泳对液体介质中悬浮的可极化粒子具有可操纵性的特点，制作了一种利用介电泳芯片的装置，如图3e所示。在微流控芯片通道内部填充蓝色使用染料，从左侧的入口将细胞样品注入，中间储层用来药物输送，在电极产生的介电泳力作用下对骨髓性白细胞进行捕获。利用介电泳芯片装置对单细胞分析，检测多药耐药(multidrugresistance，MDR)的药物流出功能中单细胞的异质性，并捕获了具有MDR活性的白血病细胞和无MDR活性的白血病细胞，将其与良性白细胞区分。这对未来的医疗试验研究提供了一个确定单细胞水平上MDR抑制的异质性新技术。图4开管式毛细管电场流微分离技术原理示意
综上所述，介电泳技术由于对尺寸相近且节点特性相差较小的微纳尺度物质分离不具有高分辨率，且传统介电泳装置存在高电压条件下易对生物细胞造成损伤，同时有效电场较小，因此可将介电泳技术与微流控技术进行联用，利用微流控技术装置的小型化设计，在低电压条件下产生较高的有效电场，对带有不同尺寸、不同介电特性的混合样品进行精准分离。
2.3电场流动分离技术
场流分离技术最早由Giddings等[72]发明，是分析分离领域用来分离大分子胶体和颗粒材料的一种分离方法，随着场流分离技术的不断发展，其也逐渐成为色谱分离体系中一项重要的分离技术。其中电场场流分离技术被越来越多的研究学者使用，其分离原理是通过在分离通道的上下壁(电极)所施加的直流电场或交流电场，对混合带电颗粒进行精准分离[73]。该技术可以根据混合样品的大小与带电性质的不同进行分离和聚焦等处理，如图1c所示。传统的直流电场流分离技术是针对通道壁施加固定电压，通道壁表面在直流电场条件下形成双电层，降低通道内有效电场，导致电场场流分离技术的分离效率大大降低。在交流电场流分离技术中，施加的交流电场根据频率调节电场方向，减缓内电极表面形成的双电层，提高通道内有效电场，起到提高分离效率的作用。目前电场场流分离技术可以对颗粒物、生物细胞和外泌体等进行有效分离，被广泛应用于微纳米颗粒和细胞分离等领域。Tasci等[74]为了改善纳米颗粒在交流电场场流分离中存在的小尺寸微纳尺度物质的扩散现象，对电参数中的偏置电压进行调节。该团队使用高于50%的偏置电压对50nm以下颗粒物进行有效分离，结果证明通过调节偏置电压可以减小扩散现象对分离纳米颗粒的影响，提高分离效率。Petersen等[75]利用交流电场场流分离技术对外泌体的分离进行研究，以交流电压为常量，流动相为变量的条件下对外泌体进行了分离，证实交流电场流分离技术可以对外泌体进行有效分离。——论文作者：崔嘉轩1，刘璐1，李东浩1，朴相范2∗
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