摘要：环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术与微流控芯片技术相结合，可实现对宠物疫病病原体的快速检测，具有高通量、特异性强、灵敏度高、操作简单、即时检测等优点。基于LAMP的微流控芯片应用于宠物疫病检测，可显著提高宠物疫病的病原学诊断能力和效率，成为宠物疫病的快速诊断及高效防控的重要手段之一。
关键词：环介导等温扩增;微流控芯片;宠物疫病;应用展望
近年来，随着城市化进程的发展和生活方式的改变，宠物饲养的数量与日俱增，同时流浪动物的数量也日益增加，由此带来的宠物疫病尤其是人兽共患病严重威胁宠物健康和公共卫生安全。在宠物疫病的防控方面，疫病高通量快速检测发挥至关重要的作用。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)作为一种核酸等温扩增技术，具有灵敏性高、特异性强、检测耗时短、操作简便等优点。目前，基于LAMP的微流控芯片利用多通道微流控芯片核酸检测的独特优势，不仅可以实现多重检测，即一次加样，同时可检测多种指标，最大限度地节约时间和成本，还适合临床现场的即时检测(Point-of-caretest，POCT)。本文就基于LAMP的微流控芯片快速检测技术在宠物疫病检测中的应用展望作一阐述。
1环介导等温扩增技术
LAMP是由NOTOMI等[1]于2000年首次提出的一种体外等温扩增核酸的方法，是目前为止应用最广泛、技术最成熟的一种恒温扩增技术。LAMP基本原理是针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括2条内引物和2条外引物)，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度(60～65℃)下不断复制扩增DNA，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。通常为了提高反应效率，还在反应体系中添加2条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。LAMP具有高特异性、高灵敏性、操作简单、快速且低成本的优点，已广泛应用于细菌、病毒和寄生虫等病原微生物的快速检测[2]。LAMP技术经过多年的发展，已形成逆转录环介导等温扩增(Re-versetranscriptionloop-mediatedisothermalampli-fication，RT-LAMP)、实时浊度定量LAMP等多种技术。
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2微流控芯片技术
微流控芯片(Microfluidicchip)是由MANZ等于20世纪90年代初率先提出[3]，将复杂的流体操控系统与功能单元模块集成在一个几平方厘米大小的芯片上，以实现整个分析过程或全部目标物的分析，因此也被称为芯片实验室(Lab-on-a-chip)。微流控芯片具有微型化、集成化、高通量、样品消耗少、快速准确、操作简便等特点，可实现传染病的现场即时检测。
3基于LAMP的微流控芯片在宠物疫病检测中的应用展望
目前，宠物疫病临床诊断最常用的方法是胶体金快速诊断技术，但由于胶体金敏感性较低，对早期感染或病原含量低的样品往往不能检出，不能满足宠物临床高通量、结果准确的检测需求。基于LAMP的微流控芯片技术，不仅可以实现检测集成化，还可以实现多通道同时检测，更能适应现场即时检测的需求。基于LAMP的微流控芯片技术已在人类传染病防控方面发挥着重要作用，但在宠物疫病防控上还没有开始应用。随着对宠物疫病微流控技术的深入研究，该技术有望在宠物疫病检测中得到广泛应用。
3.1宠物人兽共患病检测
近年来，诸如狂犬病、弓形虫病等宠物源性人兽共患病在我国频频暴发，对城市环境和公共卫生安全构成了一定威胁。快速检测技术对人兽共患病的防控至关重要。目前，基于LAMP的微流控芯片已应用多种虫媒传染病病原体检测上[4-5]。针对宠物源性人兽共患病也亟需一种快速、高通量的即时检测方法，基于LAMP的微流控芯片在宠物源性人兽共患病的应用，可应对人兽共患病给公共卫生安全带来的挑战。
3.2宠物呼吸道传染病检测
犬猫呼吸道传染病是由一种或多种病原体如病毒、细菌和真菌等感染导致的以咳嗽、打喷嚏等呼吸道症状为临床特征的疾病。因这些病原体感染临床症状相似，难以区分，只能通过检测手段加以区分，基于LAMP的微流控芯片在宠物呼吸道传染病检测尚未见报道，而基于LAMP的微流控芯片在人类呼吸道传染病检测中已有较多报道。某公司开发的呼吸道病原体LAMP十三联检试剂盒具有高效、快速、灵敏度高、覆盖面广的优点，为临床诊断和精准治疗提供快速、可靠的实验室诊断依据[6-7]。目前，某公司设计开发的快速检测呼吸道多病毒的全新微流控芯片，可一次性检测包括2019新型冠状病毒在内的19种呼吸道常见病毒，适用于常见呼吸道感染疾病的辅助诊断，也可以用于流行病学调查等领域。基于LAMP的微流控芯片，可对临床上宠物呼吸道的多种常见病原同时进行非培养的快速并行检测，很大程度上解决宠物呼吸道传染病检测周期长、确诊率低、部分细菌培养难等问题，为犬猫呼吸道传染病的病原的鉴别诊断提供依据。
3.3宠物消化道传染病检测
基于LAMP的微流控芯片已应用在人类消化道传染病病原体的多重检测中[5]。在犊牛上也有应用，比如某公司商品化的基于LAMP的犊牛腹泻检测芯片，可以鉴别诊断引起犊牛腹泻的7种病原(2种病毒、3种细菌和2种寄生虫)[8]。该技术在宠物消化道传染病检测中尚未开始应用，但有望成为宠物消化道传染病鉴别诊断的又一新手段。
4结语
分子诊断技术的发展必将加快宠物疫病病原学诊断的进程。基于LAMP的微流控芯片可以实现病原体核酸检测的高通量、自动化和即时检测，适合宠物疫病的多病原筛查，有望显著提高宠物疫病的病原学诊断能力和效率，将成为宠物疫病的快速诊断及高效防控等的重要手段之一。——论文作者：杨德全1，郁达义2，鞠厚斌1，李鑫1，沈海潇1，葛菲菲1，王建1，赵洪进1
