摘要背景：微弧氧化技术目前已被较多用于提高钛植入体骨整合性的研究中，在钛表面构建出多种含不同活性元素的多孔涂层。近年来研究发现，红景天苷具有较好的促成骨活性。聚多巴胺作为材料表面优良的黏合剂和二次吸附的载体具有较好负载活性分子的特性。目的：为进一步提高钛表面微弧氧化涂层的促成骨能力，在多孔形貌表面构建骨整合性优良的复合涂层。方法：在纯钛表面制作微弧氧化涂层，记为MAO组;进一步在微弧氧化涂层表面制作聚多巴胺涂层，记为PDA组;在聚多巴胺涂层表面加载1，2，4g/L的红景天苷，依次记为Sal-1组、Sal-2组、Sal-4组，利用扫描电镜及X射线能谱仪分析各组涂层的微观形貌、表面元素含量及分布;通过CCK-8及荧光染色实验评估各组涂层表面的细胞增殖活性，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色实验观察各组涂层的促成骨分化及矿化能力;利用计算机分子对接技术预测红景天苷分子的潜在促成骨靶点。结果与结论：①扫描电镜显示，5组试件表面为多孔微米形貌结构，平均孔径相似;X射线能谱仪分析显示，通过聚多巴胺载体可将红景天苷加载到微弧氧化涂层表面;②CCK-8实验显示，Sal-2组、Sal-4组培养第3，5天的MC3T3-E1细胞存活率高于MAO组(P<0.05);荧光染色实验显示，5组试件表面MC3T3-E1间形态差异较明显，与MAO组相比，Sal-2组、Sal-4组细胞形态更好、铺展面积大，与相邻细胞连接较好;③Sal-2组、Sal-4组培养第4，7天的的碱性磷酸酶活性高于MAO组(P<0.05);培养21d时的茜素红染色显示，各组均有一定程度的钙结节出现，其中Sal-2组、Sal-4组的钙结节数量更加明显;④计算机分子对接结果表明，细胞外调节蛋白激酶2、c-Jun氨基末端激酶3、雌激素受体β、孕激素受体可能是红景天苷发挥促成骨作用时活性较强的靶点;⑤结果表明，通过聚多巴胺将红景天苷负载到钛微弧氧化涂层表面，适当加载量的红景天苷较好地改善了微弧氧化涂层的促成骨活性。
关键词：材料;纯钛;表面改性;微弧氧化;聚多巴胺;红景天苷;成骨活性;分子对接
0引言Introduction
钛是一种高光泽的过渡金属，具有低密度、高强度、高断裂韧性、较好的生物相容性和耐腐蚀性等特点[1]。光滑表面的钛植入物没有生物活性，因此它们不具备较好的骨整合性能，最近的研究集中于利用表面改性技术赋予钛植入体较好的生物活性[2]。
表面改性技术用于改善植入体表面的生物相容性并使其具备特定的生物学功能，从而减少并发症并延长植入体的使用寿命[3]。钛植入体的表面改性方法主要有机械方法、物理方法与生物化学方法[4]。微弧氧化技术作为一种物理改性方法已被证明是用于增强钛植入体骨整合性的有效表面处理方法，并且已开发出多种生物活性元素掺入的多孔涂层[5]。先前的研究发现，微弧氧化处理可以使得钛植入体表面形成多孔微米结构，这种结构特性有助于成骨细胞的快速黏附和增殖[6-8]。WANG等[9]的研究表明，微弧氧化处理后得到的二氧化钛/硅磷(TiO2/SiP)涂层显著促进了MC3T3-E1细胞的早期增殖、后期分化和骨矿化能力。此次实验旨在进一步提高TiO2/SiP涂层的促成骨能力，在多孔微米形貌表面构建复合涂层。
利用聚多巴胺进行植入物表面处理属于生物化学改性方法，多巴胺在碱性环境下可自聚成交联的强黏性聚多巴胺纳米层，结合于材料表面的聚多巴胺具有吸附生长因子和小分子化合物的能力[10-11]。LEE等[12]将重组人骨形态发生蛋白通过聚多巴胺层固定在三维打印的聚己内酯支架上，显著增强了小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖和成骨活性。
红景天苷是从红景天根中提取的主要活性化合物，具有多种药理作用[13]。梅国华等[14]的研究发现，红景天苷通过调控人成骨样细胞系(MG-63)的细胞周期分布及上调Runx2和Osterix表达促进其增殖和成骨分化。最新研究报道，红景天苷对大鼠颅骨成骨细胞的增殖、分化及矿化有明显的促进作用[15]。
实验利用聚多巴胺载药技术在多孔微米表面加载具有骨诱导作用的红景天苷形成复合涂层，发挥协同成骨作用;从涂层表面微观结构及元素分布、涂层对MC3T3-E1细胞的增殖、碱性磷酸酶活性及细胞矿化影响两个方面对载红景天苷聚多巴胺-多孔微米复合涂层的材料学特性、细胞相容性和促成骨活性进行研究，并利用分子对接技术预测红景天苷的潜在促成骨靶点，研究结果为被红景天苷功能化的医用钛植入体，作为具有较好骨整合性的植入材料提供了理论依据。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计材料及药物加载工艺、细胞学基础实验及计算机分子对接。
1.2时间及地点实验于2019年8月至2020年8月在上海健康医学院附属嘉定区中心医院中心实验室完成。
1.3材料医用纯钛(TA1，宝鸡市正丰有限公司);MC3T3-E1细胞(中科院上海细胞库);alpha-MEM培养基、胎牛血清(Gibico，USA);鬼笔环肽、DAPI(Solarbio，中国);CCK-8试剂盒(东仁，日本);茜素红、成骨诱导培养基(赛业，中国);碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);多聚甲醛(biosharp，中国);十六烷基氯化吡啶(Sigma，USA);PBS、Tris-HCl缓冲液(碧云天，中国);红景天苷(成都瑞芬思生物科技有限公司);盐酸多巴胺(上海阿拉丁试剂公司);场发射扫描电镜SU8010(日立，日本);能谱仪(X-MAX150，牛津，英国);恒温箱(赛默飞，中国);荧光显微镜、倒置显微镜(Leica，德国)。
1.4方法
1.4.1纯钛-微弧氧化处理工艺将医用纯钛进行切割加工处理，处理后得到长宽均为10mm、厚度为1mm的纯钛试片，再分别经240-1500目砂纸逐级打磨至表面光滑且无痕。放入无水乙醇中超声清洗5min，蒸馏水冲洗3遍。纯钛试片浸泡在六偏磷酸钠5g/L、硅酸钠12g/L、氢氧化钠3g/L、甘油2g/L组成的电解液中，进行微弧氧化处理。微弧氧化设备(中国东莞微弧环保公司)-70kW双极性脉冲微弧氧化电源，电流3A/dm2，频率600Hz，占空比25%，处理时间5min。
1.4.2聚多巴胺载红景天苷涂层制备及试件分组将微弧氧化处理后的钛片放入无水乙醇中超声清洗10min，蒸馏水冲洗3次。自然晾干后放入3mol/L氢氧化钠水溶液中，60℃水浴1h，进行碱活化处理，然后用蒸馏水冲洗3次。再放入含0.5g/L多巴胺的Tris-HCl(pH=8.5)缓冲液中，避光浸泡12h。取出后，用蒸馏水冲洗3次，自然晾干。将晾干后的纯钛-微弧氧化-聚多巴胺试件分别放入，1，2，4g/L的红景天苷PBS溶液中，浸泡12h。取出后用蒸馏水冲洗3次，自然晾干，以备使用。使用前在紫外灭菌箱中，正反面各照射2h。
将纯钛-微弧氧化处理试件编号为MAO组，纯钛-微弧氧化-聚多巴胺-0g/L红景天苷试件编号为PDA组，纯钛-微弧氧化-聚多巴胺-1g/L红景天苷试件编号为Sal-1组，纯钛-微弧氧化-聚多巴胺-2g/L红景天苷试件编号为Sal-2组，纯钛-微弧氧化-聚多巴胺-4g/L红景天苷试件编号为Sal-4组。
1.4.3材料表面形貌表征及元素分布测定利用场发射扫描电镜SU8010观察涂层的表面形貌，并用能谱仪X-MAX150对涂层的元素组成及分布进行分析。
1.4.4MC3T3-E1细胞活力测试及细胞骨架形态学观察选取传代培养后处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，将细胞浓度调整为2×107L-1。5组试件平铺在24孔细胞培养板中，将1mL细胞液接种在含试件的孔中，每组设置3个复孔，各自恒温箱内培养3，5d后弃去上清液，PBS冲洗3次，按比例放入CCK-8与无血清培养基的混合液。继续培养1.5h后吸取上清液100µL，放入96孔细胞培养板中，用酶联免疫测试仪上测定吸光度值。以上实验重复3次。细胞存活率=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。其中将MAO组作为对照孔，CCK-8与无血清培养基的混合液作为空白孔。
分别将5组试件平铺在24孔板中，将对数生长期的MC3T3-E1细胞液加入含有试件的孔中，每孔1mL，细胞浓度为2×107L-1。恒温箱内培养24h后，吸取上清液并用PBS冲洗3次。按0.5mL/孔加入40g/L多聚甲醛，37℃恒温下固定10min，PBS冲洗3次。分别采用鬼笔环肽和DAPI对细胞进行染色，荧光显微镜下观察细胞形态。
1.4.5碱性磷酸酶细胞成骨活性检测碱性磷酸酶是成骨细胞早起分化的关键酶，碱性磷酸酶的分泌量可在一定程度上反映细胞成骨分化状态。为观察不同涂层对成骨细胞分化的影响，采用氨基安替吡啉测酚法检测分析不同涂层对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶分泌的影响。将5组试件平铺在24孔板中，取1mL对数生长期的MC3T3-E1细胞液加入含有试件的孔中，细胞浓度为2×107L-1，加入成骨诱导液(成分：基础培养基、双抗、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松)诱导培养(2d更换一次培养液)，每组设置6个复孔。培养4，7d后，吸取各孔200μL上清液至1.5mL离心管中，1000r/min离心5min。使用碱性磷酸酶检测试剂盒，取30μL上清液置于96孔板中，分别加入50μL缓冲液和基质液，待混合均匀后37℃恒温孵育15min，加入150μL显色剂，混匀，于520nm波长下测定吸光度值。以上实验重复6次，求出平均值。
1.4.6茜素红染色灭菌后的试件在细胞培养环境中的成骨诱导培养基中浸泡24h，制备提取物。根据ISO10093标准，试件表面积与介质的比例设定为1.25cm2/1mL，采集不同试件的提取物，4℃条件下保存，用于细胞矿化实验[16]。
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将对数生长期MC3T3-E1细胞以2×104/孔接种到含有提取物的24孔板中，成骨诱导培养21d，每2d更换一次成骨培养液，每组设置3个复孔。第21天时吸除培养基，并用PBS冲洗细胞，在40g/L多聚甲醛中固定半小时后，茜素红染色观察成骨细胞分化情况。用PBS冲洗3次，去除非特异性染色，倒置显微镜拍摄结节照片后，用10%十六烷基氯化吡啶溶解结节，在562nm处测定吸光度[17]。
1.4.7红景天苷的骨代谢靶点预测根据文献报道的骨代谢相关的信号通路，主要有丝裂原激活蛋白激酶通路、骨形态发生蛋白通路、Wnt/β-catenin信号通路，利用PDB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)，将骨代谢相关信号通路上蛋白靶点的三维结构信息及相应原配体信息，整理成骨代谢相关靶蛋白库(表1)[18]。将上述骨代谢相关靶蛋白与其对应的原配体，进行分子对接，并将得到的对接自由能作为参考。化合物与蛋白的结合自由能越低，说明该对接越稳定，结合情况越好[19]。结合自由能值小于-20.9kJ/mol，说明化合物与蛋白可以自发结合[20]。将红景天苷与每个骨代谢相关蛋白进行对接，当结合自由能值小-20.9kJ/mol时，将该蛋白视为红景天苷的潜在靶点。实验使用AutoDockVina软件进行分子对接[21]，每个蛋白的活性位点信息由计算原配体所在位置获得。
1.5主要观察指标①不同涂层表面的微观形貌、元素含量及分布;②不同涂层表面MC3T3-E1细胞增殖活性及形态观察;③不同涂层对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶分泌量的影响;④不同涂层对MC3T3-E1细胞矿化的影响;⑤计算机分子对接中，红景天苷分子与各个蛋白的结合自由能值。
1.6统计学分析实验中的原始数据用Graphpadprism.7软件进行处理，利用单因素方差分析(One-WayANOVA)对所得数据进行统计学分析，统计数据均用x-±s表示，P<0.05认为两组数据差异有显著性意义。
2结果Results
2.1各涂层表面微观形貌特征扫描电镜分析表明，见图1，经过微弧氧化处理后纯钛表面成功构建了多孔微米形貌结构。MAO组、PDA组、Sal-1组、Sal-2组、Sal-4组试件表面的平均孔径分别为3.68，3.16，3.60，3.29，3.76µm。经过单因素方差统计分析，各组之间均孔径比较差异无显著性意义(P>0.05)，说明通过聚多巴胺对微弧氧化表面改性后对多孔形貌没有影响，涂层依然具有良好的多孔微米特征。
2.2材料表面元素含量及分布能谱仪分析表明，经过微弧氧化处理后，纯钛表明成功掺入Si、P活性元素;与MAO组相比，PDA组出现了C元素的分布，提示聚多巴胺成功载入到微弧氧化表面;随着加载的红景天苷质量浓度的升高，涂层表面的C元素含量也随之升高，间接提示药物成功地加载到涂层表面，见图2A。根据能谱仪maping结果，几种元素在涂层表面分布较为均匀，见图2B。
2.3各组涂层表面细胞活力及形态观察采用细胞电化学方法检测MC3T3-E1细胞的增殖活性。培养第3天时，和MAO组相比，PDA组对细胞增殖无明显促进作用;和MAO组相比，Sal-2组和Sal-4组均对细胞增殖有明显的促进作用，见图3A。培养第5天时，和MAO组相比，Sal-2组、Sal-4组依然对细胞增殖具有明显促进作用，见图3B。进一步采用DAPI鬼笔环肽染色法观察各组细胞形态，各组细胞形态差异较明显，与MAO组相比，Sal-2组、Sal-4组细胞形态更好、细胞铺展面积大，与相邻细胞连接较好，见图4。
2.4各组涂层表面细胞碱性磷酸酶活性诱导培养第4天时，和MAO组相比，PDA组、Sal-1组的碱性磷酸酶活性无明显差异，Sal-2组、Sal-4组的碱性磷酸酶活性明显升高，见图5，这也进一步证明了能谱仪元素检测的结果，可能由于Sal-1组加载的药物量较低，使其无法达到较好的促细胞分泌碱性磷酸酶效果。诱导培养第7天时，和MAO组相比，Sal-1组对碱性磷酸酶分泌仍然无显著作用，Sal-2组、Sal-4组依然显著的促进了碱性磷酸酶分泌，见图5。这进一步提示了，红景天苷可能需要一个较高的加载浓度才能发挥较好的促成骨分化作用。
2.5各组涂层表面细胞矿化能力茜素红染色显示，诱导培养21d的各组成骨细胞均有一定程度的钙结节出现，其中Sal-2组、Sal-4组的钙结节数量更加明显，见图6A，提示可能具有更好的促成骨分化作用。将各组钙结节溶解下来后在562nm波长下测量吸光度值，发现Sal-2组、Sal-4组的促细胞矿化能力与MAO组相比显著增加，见图6B。这也提示，通过加载红景天苷到TiO2/SiP涂层表面可以进一步提高涂层的促细胞矿化能力。
2.6红景天苷的潜在促成骨靶点对红景天苷与17个骨形成相关靶点的分子对接结果进行分析，发现红景天苷与各个靶点的结合自由能值均小于-20.9kJ/mol，见表2。
提示其可能通过多靶点发挥较好的促进骨形成作用，比较红景天苷与各靶点的原配体的结合自由能值，将二者差值视为相对得分(原配体结合自由能值-红景天结合自由能值)，相对得分越高，说明红景天苷越接近该蛋白与其原配体的结合稳定性。红景天苷相对得分较高的靶点有，细胞外调节蛋白激酶2、c-Jun氨基末端激酶3、雌激素受体β、孕激素受体，因此推测这4个靶点可能是红景天苷发挥促成骨作用时，活性较强的靶点。部分分子对接作用力情况，如图7所示。
2.7涂层生物相容性由涂层表面细胞活力及形态观察实验可知，载红景天苷-聚多巴胺-多孔微米复合涂层具有良好的细胞相容性。——论文作者：梁鹏晨1，2，3，史俊峰2，4，孙苗苗1，2，梁冬雨2，3，沙爽2，5，易清清2，3，常庆1，2
