摘要烟草中多酚类物质的种类及含量对烤后烟叶的香气品质、烟叶色泽及香吃味有重要影响，有效提取分离与确定烟草中的多酚类物质可提高烤后烟叶的品质，增加烟草制品的经济利用价值。本文详细介绍了溶剂萃取、超声辅助提取、微波辅助提取和超临界流体萃取四种提取烟草多酚的常用方法，以及高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)和近红外光谱法三种测定烟草多酚的分析方法，综述了提取分离及分析烟草多酚新技术的研究现状，同时对各方法的优缺点进行比较，并探讨了当前亟待解决的问题及工业化利用前景，使烟草多酚能更广泛地应用于食用、药用等领域，增加烟草多酚的实际应用价值。
关键词烟草多酚类物质提取分离分析检测
烟草作为我国重要的工业性原料作物，对我国农产品财政收入贡献较大[1]。据资料报道，烟草中所能测出的化合物约有300多种[2]，其中多酚类物质能达烟叶干重的0.5%～6%[1]，含量较为丰富，对烟叶以及烟草制品燃吸后产生的烟气进行检测，已检测到的多酚可达280多种[3]。烟草中占比最多的三种多酚为绿原酸、芸香苷和莨菪亭[4]，其中绿原酸含量可达烟草总多酚含量的75%～95%[5]。烟草中多酚类物质的种类及含量对烟叶色泽、卷烟香气、卷烟吸味有着重要影响，是评估烟草制品的重要品质标准[6～8]。所以，有效提取分离与研究烟草中的多酚类物质，并将其应用到食品、医药保健等领域，不仅能提高烟草相关产品的品质标准，还能增加烟草制品的经济利用价值。
多酚是一类植物次生代谢物质，属于植物单宁类，含有多个酚羟基结构，在植物的叶片中最为常见[9]。植物多酚能使机体内自由基得到有效清除，机体衰老进程得以缓解[10]，心脑血管等慢性疾病得到有效预防[11]，能抵抗神经性疾病[12]，降低癌症风险[13]等，因此在营养食品、医药保健等领域常被用作抗氧化剂、抑菌剂、防腐剂等。本文主要综述了烟草中多酚类物质的有效提取分离与检测方法，介绍了国内外关于烟草多酚的研究现状，以期为烟草多酚的后续获取利用和工业化生产提供参考。
1烟草中多酚的提取分离技术
1.1有机溶剂提取法
溶剂萃取的关键在于要根据相似相溶性特征选择与烟草中待提取活性成分的性质相对应的溶剂。多酚类物质中含有酚羟基极性基团，选择针对其溶解度较好的甲醇、丙酮作溶剂效果较好[14]。为防止多酚分子发生醇解反应，通常选用丙酮-水体系为溶剂，所提多酚多为倍酸酯多酚;若选用弱酸性醇-水体系为溶剂，所提物质多为单宁类多酚。pH在酸性范围时，多酚大多以分子形式存在于植物体中，pH在碱性范围时，则多数为负离子状态，因此，可调节萃取剂的pH选择性萃取不同组分。此外，可依据目标多酚的分子量差异选择合适的萃取溶剂，若所提多酚分子量较低，可选用乙醚为溶剂;若所提多酚为中等分子量多酚(单宁类)，既可选用乙酸乙酯作溶剂，也可选择丙酮水溶液作溶剂;当所提多酚分子量在1500左右时，可选用水作溶剂;而大分子量多酚在热碱溶液中提取效果较好[15]。有机溶剂萃取法操作便捷、成本低、溶剂易回收、工业放大容易，但萃取物中往往含有多种化学性质相似的成分，导致有效成分含量较低，且提取效率不高、耗时较长、溶剂残留较多，所以，通常采用溶剂提取法对烟叶中的化学成分进行粗提，之后再根据需要对粗品进行纯化。由于烟草制品主要为吸食性消费品，选择溶剂时必须考虑对人体健康的影响，绿色、无毒、无污染的乙醇-水体系常常成为首选提取剂。
1.2超声辅助提取法
超声波具有强空化作用，会产生高速微射流及强剪切力，促使物质破壁而出，能增强植物成分溶出的速率，常常辅助于溶剂提取法。超声波辅助提取法可加速萃取时间，所需温度较低，萃取效率高，能极大地降低溶剂的使用体积和成本[16]，较常见于提取植物中的天然活性成分。陈森林等采用响应面Box-Behnken中心组合研究优化超声辅助提取烟叶多酚的工艺，确定最终提取溶剂为40%～80%乙醇水溶液，料液比10～30mL/g，在50℃条件下50W提取30～45min，所得萃取物含8种多酚类致香前体物质(绿原酸、莨菪亭、咖啡酸、香豆素、芸香苷、新绿原酸、莰菲醇-3-0-芸香糖苷、隐绿原酸)，每克烟叶中的总多酚含量可达44.28mg[17，18]。Gu等[19]研究了一种动态超声辅助提取干烟叶中多酚的方法，以甲醇(含0.5%抗坏血酸)为溶剂，超声振动频率为35kHz，35℃下用6mL溶剂(流量0.5mL/min)萃取10min，所得提取物中含绿原酸、艾蒿素、芦丁、东莨菪素和槲皮素等5种多酚。与静态超声辅助提取法相比，提取多酚所需时间从30min缩短为10min，回收率由85%显著提高到96%，所提取5种多酚的总含量由2.150mg/g增加为2.225mg/g，且溶剂消耗也大大减少，说明动态超声辅助提取明显优于静态超声辅助提取。由于超声波衰减因素的存在，会导致大直径提取罐周壁形成一个无空化效应的超声空白区域，仅使一环形空间可得到超声的有效影响;另外，较高的设备成本以及设备易损性也制约了超声波辅助在实际工业生产过程中的应用。
1.3微波辅助提取法
微波与物料的相互作用及其强度取决于物料的介电特性，微波穿透低介电损耗物料时，微波能吸收较低;穿透高介电损耗物料时吸收的微波能呈先增后减趋势;穿透非介电损耗物料时几乎不吸收微波能。因此，介电特性与物料的化学成分有较大相关性，微波辅助适应的场所需与物料的介电特性匹配。微波辅助溶剂萃取的本质在于微波强化了传热传质作用，避免了热对流、热传导和热辐射等方式中的能量损失，使物料加热更快、更均匀，从而强化传质过程，有利于物质的溶出。某些场合，微波萃取过程中产生的高压允许溶剂在超过常压沸点的温度下仍处于液体状态[20]，对溶解过程十分有利。关于微波辅助提取天然产物中化学成分已有系列研究报道[21]。王海燕等[22]以提高总多酚提取率为目标，探究出提取烤烟烟叶中绿原酸、芸香苷的微波辅助提取条件:所用溶剂为53%甲醇(11mL/g)，560W微波辐照提取70s，每克烟叶中所提总多酚量可达22.38mg。Chen等[23]通过微波辅助提取烟草多酚，若温度达到120℃或更高，萃取时间可短至6min，并能萃取出更多的热降解成分。已有报道表明，微波辅助萃取法提取时间较短、溶剂需求较少、效率高、能耗低，但由于物料的不均匀性，不能使所有物料接收到同等微波辐照，整个体系受热不均，从而导致物料的部分区域提取不充分，工艺放大难;当提取溶液为有机溶剂时，防爆问题更为凸显，整个实验过程安全性和不稳定性因素较多。至今，微波辅助提取烟草多酚还仅限于实验室阶段。
1.4超临界流体萃取法
超临界流体萃取技术(Supercriticalfluidextraction，SFE)可将有效成分的提取和分离结合于一体，依据超临界流体在其临界压力及临界温度以上对天然产物中的低沸点或热敏性有效成分具有较强溶解能力进行分离[24]。杨菁等[26]采用GC-MS检测了超临界流体萃取的烟梗中的成分，主要分为五类致香成分:美拉德及焦糖化反应相关中性化合物、碱性化合物、酚类物质、酸类和烟草本香类物质，其中酚类物质主要为4-乙烯基愈创木酚。并且随温度逐渐升高，一些碳水化合物会发生焦糖化反应，生成小分子有机酸、羰基化合物和呋喃类等挥发性产物。赵卉[27]探索的超临界CO2萃取烟叶中茄尼醇的优化工艺条件为:以95%乙醇作夹带剂，在萃取压力20MPa、温度45℃、分离压力5MPa、温度35℃、CO2流量4.8L/h条件下萃取3h，茄尼醇的提取率达94.0%，提取物中茄尼醇的含量达33.0%。超临界萃取技术已被广泛应用于烟草加工业中，主要用于提取茄尼醇和尼古丁等化合物，以及萃取烟草中的低沸点多酚及其转化产物。
1.5其他新技术
近年来，除了上述烟草多酚的常用提取方法，一些新技术如加压液相萃取法、深共熔溶剂萃取法、酶辅助提取法及电渗析提取法等逐渐应用于烟草多酚的提取实验中。
1.5.1加压液相萃取技术
加压液相萃取是通过高温高压加快萃取进程和提高产量的一种萃取技术。高温高压能增加传质速率、增大化合物的扩散和溶解度、降低溶剂粘度，进而影响萃取动力学。此外，在萃取过程结束后不需过滤萃取物，其原料仍可保留在萃取池中，操作过程简单。并且该技术的效率高，溶剂消耗低，可使用环境友好型溶剂，如水或乙醇。Shifflett等[28]成功将加压液相萃取法应用到烟叶多酚的提取中，通过超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱技术测定出绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、芦丁、莨菪亭、烟花苷六种多酚在烤烟烟叶、调制烟叶、晾干烟叶中的总含量分别为18～41mg/g、5～27mg/g和0.5～3mg/g。加压液相萃取法与固相萃取技术相结合，可实现多酚物质及其他化合物的完全分离[29]。Chen等[30]经过加压液相萃取和固相萃取纯化，对干烟草和烤烟烟叶中的多酚进行了提取与鉴定，以含0.5%抗坏血酸的无水甲醇为溶剂，在40℃条件下提取10min，确定了烟草中含有绿原酸、七叶亭、东莨菪内酯、芦丁、槲皮素五种多酚。
1.5.2深共熔溶剂提取法
深共熔现象又称低温共熔，是以一定摩尔比的氢键受体和氢键供体为原料，按照一定比例反应，制备成可使反应物熔点下降的低温共熔混合物的现象。Abbott等[31]研究表明，可加热季铵盐(氢键受体)和酰胺类(氢键供体)化合物形成低温共熔体系，二者并称为深共熔溶剂。深共熔溶剂体系的熔点较低(大都低于95℃)，分离过程的操作温度范围较广，使传输介质过程更易进行[32];深共熔溶剂的黏度范围在500mPa·s以下，随温度升高，体系的氢键供体含量会越高，黏度也随之下降。深共熔溶剂被认为是替代有机溶剂的最佳选择[33]，能稳定维持在较宽电位范围内，蒸气压较低，不易燃烧，导电性能良好，同时合成成本低、合成路线简单、无毒环保等优点也对其发展更为有利[34，35]。尚宪超等[36，37]成功探究了超声辅助深共熔溶剂(含40%水)提取干烟叶中绿原酸和芸香苷的方法，通过混合加热苹果酸(供体)和氯化胆碱(受体)形成深共熔溶剂，在50℃条件下萃取30min，每克烟叶中所提取绿原酸、芸香苷量分别可达16.95和8.53mg，其提取效果及回收率均优于有机溶剂萃取。
1.5.3酶辅助提取法
酶辅助提取法首先需要利用一种酶或多种酶联合(纤维素酶和果胶酶)对实验原料进行预处理，然后再以醇类溶剂进行提取。刘佳佳等[38]验证了采用酶辅助提取法以金银花为原料提取绿原酸，相比乙醇索氏提取法所提绿原酸得率提高约25.97%。该方法反应条件温和，纤维素酶处理可加速溶出胞内物质(如绿原酸)，可有效提取植物多酚，但鲜有文献报道将酶辅助提取法用于提取烟草多酚的实验中;且采用酶辅助提取法操作较为繁琐，经济成本较高。
1.5.4电渗析分离技术
电渗析采取在溶液中通直流电的方式，使溶液中的(带电)离子物质从一种溶液穿过一种或多种选择性渗透膜转移到另一种溶液中，从而实现电化学分离[39]。离子交换膜的性质主要取决于聚合物基质的类型和固定离子团的浓度及类型，聚合物基体交联的程度决定了结构基体的离子约束水平及其孔隙率和孔径，孔隙大小会影响离子的渗透性，从而依据选择性渗透原理达到分离目的[40]。由于多酚分子带有电荷，在电渗析器中循环烟草提取物，多酚可以沿电场梯度移动，穿过膜并离开主体溶液，从而选择性分离多酚。Bazinet等[41]利用烟草中多酚电迁移的差异性成功分离出绿原酸、芦丁和东莨菪内酯。
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综合对比以上提取方法，各方法都存在其自身的优势及缺陷。溶剂浸取法工业放大容易，可一次性大量提取烟草多酚;超声辅助提取法是目前实验室及工业化提取烟草多酚的较常用方法，该方法所提取烟草多酚种类较多，工业操作简便，提取率较高;微波辅助法一次性提取速度快，可大大降低实验的时间成本;超临界流体萃取技术将萃取、分离过程相结合，可简捷高效提取低沸点多酚;加压液相萃取技术与固相萃取技术相结合可实现多酚与其他化合物的完全分离，大大提高所提取多酚的纯度;深共熔溶剂提取法绿色无污染，所使用溶剂易回收，可减少后处理操作步骤;酶辅助提取法反应条件较温和，可降低烟草多酚降解的可能性;电渗析分离技术可选择性分离烟草中的多酚及其他化合物，简化后续纯化步骤。根据所需提取的多酚物质种类及所需达到的目标要求选择合适的实验室提取工艺或工业化提取方案，会极大提高提取效率，降低实验成本。
1.6烟草中多酚的分离纯化方法
对于烟草中多酚物质的研究，大多局限于提取层面，不能将多酚物质完全分离开，对烟草多酚后续的分析与应用限制较大。近年来，对烟草中多酚的分离纯化研究得到广泛关注，普遍应用大孔树脂吸附、固相萃取、超滤法和层析法纯化烟草多酚，其中尤以大孔树脂吸附最为常用且分离效果最好，大孔树脂可在短时间内快速吸附较大容量的溶液，选择性好，不易受无机物影响，解析率高，再生简单，是一种新型分离材料，适于工业化生产[42]。张献忠等[43]以废次烟叶中所提多酚为原料，对比了6种大孔树脂吸附和解吸烟草多酚的效果差异，验证了D101大孔树脂能够较好的富集纯化烟草多酚，优化出利用大孔树脂纯化多酚的操作条件为，提取液浓度2.5mg/mL，pH4.0，上样液流速2.0mL/min，以80%乙醇为洗脱液，流速2.0mL/min，在此条件下，纯化效果最好，烟草多酚的动态回收率达70.37%。此外，固相萃取技术具有耗时短、操作便捷等优点，能选择性地将目标组分与干扰物质分离，Chen等[30]应用固相萃取技术清除提取物中的脂类化合物，选用C18固相萃取柱，以3mL0.01mol/L的盐酸洗涤后，用20mL甲醇洗脱，实现了对烟草中绿原酸、七叶亭、东莨菪内酯、芦丁、槲皮素五种多酚的纯化。总体而言，烟草中多酚的进一步分离纯化对烟草工业化应用具有重要意义，将会成为该领域研究的新焦点。
2烟草中多酚的分析检测方法
多酚物质的定性定量以及结构分析对于烟草多酚的功能活性评价至关重要，由此，确定一种高灵敏度和高选择性的多酚分析方法至关重要，研究人员也不断开发出新方法新技术用于多酚成分的分析。目前较常使用高效液相色谱(HPLC)法测定单体酚，利用HPLC-串联质谱法鉴别与分析新化合物，以及采用近红外光谱法测定烟草中的多酚总量。
2.1HPLC法
HPLC法定量准确、灵敏度高，通过与标准物质的保留时间进行比对确定单体酚组成，该方法是目前测定分析植物多酚较为常用的方法。在测定过程中，通常将适量酸性抑制剂(如甲酸、乙酸、磷酸和三氟乙酸等)加入到流动相中，以此减弱酚酸类化合物的电离，获得较好的出峰效果。沈进等[44]用HPLC法选用Agilent1100NovaPakC18柱(3.9×150mm)，分别以甲醇、磷酸二氢钾缓冲溶液(0.05mol/L)为流动相，在345nm以0.5mL/min进行梯度洗脱，定量测定出了不同烟叶中的绿原酸、莨菪亭、隐绿原酸、芸香苷和新绿原酸5种多酚。余小芬等[45]选用SunFireC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，在340nm以甲醇/乙酸(98∶2)、水/乙酸(98∶2)为流动相进行梯度洗脱，利用HPLC法同时定量测定了所提绿原酸、莨菪亭和芸香苷。HPLC对于低分子量烟草多酚的检测效果较好，却不能准确测定出复杂结构的大分子量多酚物质。
2.2高效液相色谱-串联质谱法
HPLC需串联质谱使用才能鉴定出复杂结构的未知化合物，液质联用技术是目前测定植物多酚成分的有效方法。电喷雾技术属于软电离质谱技术，通过提高源内锥孔电压使被测化合物在离子源内发生碰撞诱导裂解，通过碎片离子确定所测物质的分子量，从而实现化合物的结构鉴定，必要时需通过正负两种模式进行验证[46]。Zhong等[47]利用HPLC-ESI-MS法测定研究了烟草中的多酚类物质，成功将该方法应用于定性定量分析烟草中的多酚类物质中。孔光辉等[48]选用WatersBEHC18色谱柱(15cm×2.1mm，1.7μm)，以含0.1%甲酸和0.2mmol/L醋酸铵的水和乙腈作流动相，以0.25mL/min梯度洗脱;质谱分析喷雾电压为4kV，帘气压力为0.276MPa，电喷雾离子源温度为700℃，辅助气1(413kPa)，辅助气2(344kPa)，去簇电压为100V，定量分析出烟叶中的18种多酚。该方法操作简捷、定性定量准确，有利于对烟草多酚的后续分析。
2.3近红外光谱法
有机分子中的C-H、N-H、O-H和C-O等基团在近红外区域范围内会吸收基频的振动倍频与合频，包含丰富的信息，所以，与这些基团有直接或间接关系的成分可利用近红外光谱技术测出[49]。该方法具有方法精度高、稳定性好、能降低检测成本等优点，测定烟草多酚的效果较好。章平泉等[50]建立了关于卷烟中多酚(绿原酸、新绿原酸和芸香苷)含量的近红外数学模型，将所建立的模型预测值与化学值进行比较得，新绿原酸和芸香苷的最大相对误差均在5%以内，绿原酸平均相对误差最小为1.66%，芸香苷的平均相对误差最大为2.88%，但在5%范围内，说明用近红外数学模型预测的准确度接近化学方法，验证该模型具有良好的准确性和稳定性，可快速、准确测定出卷烟中多酚类物质的含量。吴玉萍等[51]利用傅里叶变换近红外漫反射光谱仪建立了烟草中多酚的近红外模型，近红外预测值与实测值的平均相对误差为2.04%，说明近红外与分光光度法的测量差异较小，可用于预测未知烟草样品中的多酚含量，能够快速定量测定多酚总量，方法可行性较强。
2.4其他分析检测方法
随着研究的深入，一些其他方法也在检测烟草中多酚物质中得到应用。孙玉刚等[52]利用流动注射电致化学发光法测定了香烟中的绿原酸;吴灵等[53]利用分子印迹聚合物和压电石英晶体传感器制备出可检测绿原酸的模拟生物传感器，测定出烟草中绿原酸的含量;李应金等[54]采用分光光度法测定烟草中的总多酚含量，确定在540nm处检测效果最优，并探究出影响总多酚含量测定的因素包含显色时间及显色温度，通过与高锰酸钾滴定法对比验证此方法操作更加便捷，测定结果更为准确，成本更低;彭友元等[55]采用毛细管电泳电化学检测法在16min内同时测定了烟草中的芦丁、绿原酸、槲皮素和咖啡酸，该方法重现性良好，减少了预处理及预富集步骤，可实现实际样品中多酚的测定需要。
3结语
一直以来，社会各界都在关注烟草制品的安全性问题，烟草制品的品质及安全性取决于烟草中多酚类物质的种类及含量差异，所以，国内外学者也致力于烟草中多酚类物质的提取分离与分析研究，这对烟草制品的降焦减害也具有重要意义。目前，关于提取烟草多酚的方法已有许多报道，但所提取多酚含量偏低，不利于直接应用;而针对其他干扰物质较多的情况，主要采用固相萃取技术和大孔树脂吸附等方法进一步提高烟草多酚的纯度，并将其应用到工业产品中;但要将烟草多酚更广泛地应用于食用、药用等领域，其纯化技术，尤其可工业化的纯化工艺是当前亟待研发的焦点。另外，现有检测方法仍不能将烟草多酚全部准确检测出，为更加全面综合地分析烟草中的多酚物质，以实现可选择性按需添加烟草制品中的多酚物质，增加烟草多酚的实际应用价值，还需要不断探究前处理简单、准确度高、能适于测定实际烟叶样品中更多多酚的方法。——论文作者：张花1顾丽莉1黄智华2*张尉1杜康1姚雯1彭健1
