【摘要】为建立适用于检测细菌菌环二鸟苷酸(C-di-GMP)的高效液相的方法，本文对高效液相的检测波长、流速和流动相等检测条件进行研究。研究结果确定的检测条件为：色谱柱：DiamonsilC18(2)，150×4.6mm，5μm;进样体积20μL;流速0.5mL/min;检测波长253nm;流动相A为10mmol/L乙酸铵，流动相B为10mmol/L乙酸铵甲醇溶液，梯度洗脱。该条件下建立的标准曲线R2为0.994，加标回收率为88.2%~95.3%，精密度RSD为0.98%，可用于检测细菌中环二鸟苷酸。
【关键词】环二鸟苷酸;高效液相色谱;检测方法
在很多食源性细菌中，环二鸟苷酸(C-di-GMP)细胞内重要的第二信使，对C-di-GMP可能参与的细菌代谢调控包括：细胞周期、分化、变异、细胞通讯、细菌生物膜、运动、毒性等多种生命活动和代谢[1]。C-di-GMP是以一个二聚体的形式存在的，包括两个鸟苷酸。细菌胞内C-di-GMP主要由含GGDEF(Gly-GlyAsp)结构域的二鸟苷酸环化酶(DGC)合成，并由含EAL(GluAla-Leu)或HD-GYP(His-Asp-Gly-Tyr-Pro)结构域的特异性磷酸二酯酶(PDE)降解。细菌胞内C-di-GMP浓度取决于细菌生存环境和代谢需求，但含量较低一般都在pmol级别，不容易检测。常用的检测研究一般都需要借助质谱才能完成定量分析。建立适用的高效液相色谱检验方法对降低研究成本和提高研究效率都有重要意义。本文旨在建立细菌中C-di-GMP的高效液相检测方法，为细菌的C-di-GMP研究提供方法参考。
1材料与方法
1.1材料和试剂
环二鸟苷酸钠(Cyclic-di-GMPsodiumsalt)标准品(纯度≥98%，HPLC)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;乙酸铵(Ammoniumacetate，纯度≥98%)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;甲醇(HPLC)，西陇科学股份有限公司。
1.2仪器设备
全波长酶标仪(1510)，赛默飞世尔上海仪器有限公司;高效液相色谱仪(岛津LC-16)，岛津企业管理(中国)有限公司;超纯水机(RODI-220B1)，厦门锐思捷纯水技术有限公司。
1.3标准溶液的制备
环二鸟苷酸C-di-GMP标准储备液的制备：称取1mgC-diGMP标准品，加水溶解并定容至1mL，此溶液浓度为1mg/mLCdi-GMP标准储备液。1mLC-di-GMP标准品加水溶解并定容至10mL，此溶液浓度为0.1mg/mLC-di-GMP标准中间液。根据需要将C-di-GMP标准中间液，梯度稀释成浓度为0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001mg/mL的标准工作溶液。经0.45um滤膜过滤后备用。
1.4色谱条件和检测方法
参考调整后的Christian等的方法[2]：色谱柱：DiamonsilC18(2)，150×4.6mm，5μm;进样体积20μL;流速0.5mL/min;检测波长253nm;流动相A：10mmol/L乙酸铵，流动相B：10mmol/L乙酸铵甲醇溶液，梯度洗脱。
1.5加标回收率实验
根据确定的色谱条，配置不同浓度的标准品进行HPLC分析，每一个浓度进行三次平行试验，记录色谱图，测定峰面积，得到此方法的C-di-GMP加标回收率[3]。加标回收率(%)=(C1-C2)/M×100;公式中：C1-测得的加标样品中C-di-GMP的峰面积;C2-测得的空白基质样品中C-di-GMP的峰面积;M-稀释的C-di-GMP的峰面积。
1.6精密度实验
讲C-di-GMP中间液稀释成0.001mg/mL标准溶液，采用建立的方法进行高效液相分析，计算出方法的精密度标准偏差RSD值。
2结果讨论
2.1环二鸟苷酸光谱扫描分析
环二鸟苷酸钠盐属于核苷酸环化后加盐的弱酸盐，对标准样品进行全波长扫描发现，环二鸟苷酸钠盐的最大吸收峰的光谱波长在245nm至255nm之间。最终结合参考文献选择253nm为液相检测波长。
2.2流速和梯度洗脱程序的确定
环二鸟苷酸钠盐的高效液相体系需要用盐溶性流动相。乙酸铵属于中性盐溶液，是常见的用于核苷酸类盐溶液HPLC检测流动相。最终选择A：10mmol/L乙酸铵、B：甲醇的10mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，进行流速和梯度洗脱。
2.3流速和梯度洗脱程序的确定
流动相的流速对高效液相的出峰时间和峰形都有一定影响。对比0.5mL/min和1mL/min的流速，当流动相流速为0.5mL/min时，峰形和检测效率均较理想。流动相的乙酸铵的浓度对环二鸟苷酸的结构稳定性有一定影响，需要通过调整流动相的比例以得到合适的条件。经调整流动相的比例和洗脱时间，进一步确定了洗脱梯度条件见表1，在该条件下洗脱的分离效果和峰形较好。
2.4洗脱体积和回收率实验
试验中采用0mL、5mL、8mL、12mL、15mL洗脱液体积进行流动相洗脱[4]，做加标回收实验。由实验可知，洗脱液体积为0mL时，回收率为81.2%;5mL时，回收率为86.7%;8mL时，回收率为93.5%;12mL时，回收率为97.4%;15mL时，回收率为95.1%。显然当洗脱体积12mL时，已经完全将C-di-GMP洗脱下来。从节约性考虑，该试验方法流动相的洗脱体积选择12mL。
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2.5色谱检测条件和标准品色谱图
最终确定的环二鸟苷酸HPLC检测条件为：色谱柱：Diamon⁃silC18(2)，150×4.6mm，5μm;进样体积20μL;流速0.5mL/min;检测波长253nm;流动相A：10mmol/L乙酸铵，流动相B：10mmol/L乙酸铵甲醇溶液，梯度洗脱条件：0-5min：98%流动相A，2%流动相B;5-20min：90%流动相A，10%流动相B;20-25min：10%流动相A，90%流动相B。在此条件所得到的环二鸟苷酸色谱图如图1所示。
2.6标准曲线和线性范围的确认
以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标[5]，得到标准曲线回归方程如表2所示。回归方程为y=(7×107)x-3313.3;R2=0.994。由本试验线性相关系数(0.994)，在试验浓度范围内，线性关系良好。
2.7加标回收率
将C-di-GMP标准中间液配制为0.0075mg/mL、0.0055mg/mL、0.003mg/mL的C-di-GMP标准溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后HPLC分析。由表3回收率可知，该方法回收率为88.2%~95.3%。本试验在加标浓度在0.003~0.0075mg/mL范围内，回收率良好。
2.8精密度
C-di-GMP中间液稀释成0.001mg/mL标准溶液，通过重复进样进行高效液相分析，结果如表4所示。由表4可知，该方法精密度标准偏差RSD为0.98%，这表明精密度良好。
3结论
本文对检测细菌C-di-GMP高效液相方法的色谱条件进行了研究。确定的色谱条件为：色谱柱：DiamonsilC18(2)，150×4.6mm，5μm;进样体积20μL;流速0.5mL/min;检测波长253nm;流动相A：10mmol/L乙酸铵，流动相B：10mmol/L乙酸铵甲醇溶液，梯度洗脱。该条件下建立的标准曲线R2为0.994，线性关系良好;加标回收率为88.2%~95.3%，精密度RSD为0.98%，重复性良好;可用于检测细菌中环二鸟苷酸。——论文作者：李汝锶，卫耀辉，刘永吉
