摘要：目的采用核壳色谱技术建立冬虫夏草中麦角甾醇的快速定量分析方法。方法样品经甲醇超声提取后，用高效液相色谱测定。色谱柱为Poroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm)，流动相为甲醇-水(94﹕6)，流速为1mL·min-1，柱温为35℃，检测波长为283nm。结果本方法可在15min内完成冬虫夏草中麦角甾醇的测定(10min样品提取和5min色谱分析)。麦角甾醇在7.869~94.43μg·mL-1范围内的线性关系良好，相关系数为1.0000;精密度、重复性良好，RSD均小于3.0%;加样回收率为97.2%(RSD=3.3%，n=9);对照品溶液和供试品溶液在室温下放置24h内稳定。15批不同来源冬虫夏草的麦角甾醇含量在0.133%~0.279%。结论建立的色谱分析方法简便、快速、准确，有助于提升冬虫夏草样品检测效率。
关键词：冬虫夏草;麦角甾醇;核壳色谱柱;高效液相色谱
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordycepssinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，具有补肾益肺、止血化痰的功效[1-2]。现代医学研究表明，冬虫夏草具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和调节免疫等作用[3-5]。其主要化学成分有核苷、多糖、氨糖醇、甾醇和脂肪酸等[6-8]。其中麦角甾醇为真菌类的特征甾醇，也是冬虫夏草中的重要活性成分之一，具有保护肝脏、抗纤维化、抑制肿瘤细胞等作用[9-11]。该成分经常被作为冬虫夏草药材的质量评价指标，前期研究开发了多种麦角甾醇含量测定方法，包括紫外分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法等，其中以高效液相色谱法为主[12-21]。已报道的高效液相色谱法多采用常规全多孔填料的反相柱，分析时间较长(通常在15~30min)[18-21]。核壳色谱技术是近年来发展起来的新型色谱填料技术，具有柱效高分析速度快和柱压低应用范围广的优点，已应用于多种中药(如人参、黄芪、珠芽蓼和牛樟芝)的化学成分的快速液相分析[22-25]。为了提高冬虫夏草产业化检测效率、降低检测成本，本试验采用核壳色谱技术建立了快速分析冬虫夏草中麦角甾醇含量的高效液相色谱法，为该药材的质量评价技术提升提供了科学依据。
1仪器、试剂及药材
1.1仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);色谱柱AgilentPoroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm);XS205DU型电子分析天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司);Milli-Q超纯水系统(德国默克密理博公司);P300H超声仪(德国ELMA公司);JAC-2010P超声仪(韩国KODO公司);SBL-22DT超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);Tube-Mill100研磨机(德国IKA公司)。
1.2对照品及试剂
麦角甾醇对照品(含量为96.2%，中国食品药品检定研究院，批号：110845-201604)。无水甲醇(分析纯，成都科隆试剂有限公司，批号：2020072302)，甲醇(色谱级，科鲁德化工股份有限公司，批号：880602)，水(超纯水)。
1.3药材
共收集15批冬虫夏草，经钱正明博士鉴定为冬虫夏草。其中S1~S3来自西藏那曲，S4来自青海玉树，S5~S6来自青海果洛，S7~S10来自四川甘孜，S11~S15来自湖北宜昌。
2方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验
Agilent1260型高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentPoroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm)，流动相为甲醇-水(94﹕6)，流速为1mL·min-1，柱温为35℃，进样量为2μL，检测波长为283nm，分析时间5min。理论板数以麦角甾醇峰计，应不低于2000，主峰与相邻色谱峰的分离的应不小于1.5。
2.2对照品溶液制备
取麦角甾醇对照品适量于容量瓶中，精密称定，加无水甲醇溶解并稀释，配制成浓度为314.77μg·mL-1的对照品储备液。精密量取对照品储备液2mL于20mL容量瓶中，加无水甲醇稀释成浓度为31.477μg·mL-1的对照品溶液。
2.3供试品溶液制备
取冬虫夏草粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置50mL离心管中，精密加入20mL无水甲醇，密塞，涡旋混匀，超声处理10min，取出放冷，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。
2.4方法学考察
2.4.1专属性试验
取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各1份，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，色谱结果见图1。结果显示，空白溶液在麦角甾醇出峰位置无干扰，供试品溶液中麦角甾醇理论板数为4421，与相邻色谱峰的分离度为2.2，表明该方法具有良好的专属性。
2.4.2线性关系考察
精密量取麦角甾醇对照品储备液适量于容量瓶中，加无水甲醇稀释，制得浓度分别为7.869，15.74，31.48，47.21，94.43μg·mL-1线性溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标(y)，对照品的浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，计算回归方程。测得线性回归方程为y=3.0078x-0.2755，相关系数r为1.0000，结果表明麦角甾醇在7.869~94.43μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。
2.4.3精密度
精密吸取浓度为31.477μg·mL-1对照品溶液2μL，重复进样6次，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积，计算RSD。测得麦角甾醇的峰面积RSD值为0.27%，表明日内精密度良好。精密吸取对照品溶液2μL，每天测定2次，连续测定3天，记录峰面积，计算RSD。测得麦角甾醇的峰面积RSD值为1.4%，表明日间精密度良好。
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2.4.4重复性试验
取同一批次冬虫夏草(S11)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。测得6份供试品溶液的麦角甾醇平均含量为0.273%，RSD为2.1%，表明方法的重复性良好。
2.4.5加样回收试验
取同一批次已测得麦角甾醇含量的冬虫夏草(S11)，按3个取样量(0.05，0.1，0.15g)分别精密称定3份，每份样品均按照1﹕1比例加入对照品，按“2.3”项下方法制备供试品加标溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算麦角甾醇的回收率、平均回收率及RSD，见表1。结果显示，9份供试品加标溶液的麦角甾醇回收率在93.8%~102.5%，回收率平均值为97.2%，RSD为3.3%，表明该方法的准确度良好。
2.4.6稳定性试验
分别按“2.2”和“2.3”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液各1份，在室温下放置，分别于0，4，8，12，16，20，24h进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录麦角甾醇的峰面积并计算RSD。结果显示，对照品溶液和供试品溶液中麦角甾醇的峰面积RSD分别为0.64%和1.0%，表明对照品溶液和供试品溶液在24h内稳定。
2.5样品含量测定
取冬虫夏草样品(S1~S15)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析检测。采用外标法计算冬虫夏草中麦角甾醇的含量，结果见表2。15批不同来源的冬虫夏草中麦角甾醇含量在0.133%~0.279%。
3讨论
3.1提取条件优化
麦角甾醇为脂溶性成分，文献多采用甲醇、乙醇，加热回流或超声处理的方式提取，提取时间通常为30~60min[15-21]。本研究在文献研究基础上，选择了甲醇作为提取溶剂，为实现多批次样品同时提取，选用了超声处理的方式。当料液比1﹕100，超声时间为60min时，提取1次、2次、3次，测得麦角甾醇的含量无明显差异，说明超声提取60min可确保冬虫夏草中的麦角甾醇提取完全。以超声60min时的麦角甾醇提取率为100%，超声1，5，10，20，30，40min，当超声时间达到10min，提取效率均在95%以上，因此选择10min作为提取时间。本文还考察了料液比对提取效果的影响，结果显示，当料液比1﹕50，超声10min时，提取率未达到95%。为兼顾提取效率和提取效果，本研究选择甲醇为提取溶剂，1﹕100的料液比，超声处理10min作为最佳提取条件。
3.2色谱条件优化
前期关于虫草类产品中麦角甾醇的定量分析多采用5μm粒径的全多孔反向色谱柱，分析时间较长通常在15~30min[18-21]。核壳型色谱柱的填料也称为表面多孔型填料，其结构由实心内核和多孔壳外层组成。近年来，已有许多研究者将核壳型色谱柱运用到中药的快速分析领域。本文采用亚3μm粒径的核壳型色谱柱，参考文献选择了甲醇-水作为流动相，经考察，使用94%甲醇等度洗脱，可在5min内实现冬虫夏草中麦角甾醇的分离分析。比较了不同品牌的色谱柱(AgilentPoroshell120SB-C18、WatersCortecsC18、ACEUltraCoreSuperC18)，麦角甾醇与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，分离效果均良好。
3.3样品分析
本文所建立的分析方法在15min内即可完成样品的提取和分析，对15批不同来源的冬虫夏草样品进行测定，结果显示麦角甾醇的含量在0.133%~0.279%，平均含量在(0.212±0.040)%。过立农等[15]建立的色谱分析方法需要45min完成冬虫夏草样品麦角甾醇含量的测定，27批样品的麦角甾醇含量在0.0288%~0.173%，平均含量在(0.116±0.039)%;张薇薇等[21]报道的方法耗时50min以上，11批冬虫夏草样品的麦角甾醇含量在0.0018%~0.497%，平均含量在(0.172±0.164)%。为了进一步对新建立分析方法和已报道文献方法进行比较，采用文献报道方法[18]和新建立分析方法对冬虫夏草样品(S11)进行了测定，结果显示2种分析方法测得样品中麦角甾醇的含量分别为(0.270±0.001)%和(0.271±0.001)%，测定结果基本一致;新建立分析方法所用测定时间(15min)仅为文献报道方法(85min)的1/5不到。
综上所述，本文所建立的测定冬虫夏草中麦角甾醇的分析方法，在15min内可以完成样品的提取(10min)和色谱分析(5min)，并且样品测定结果和前期报道方法结果一致。该方法具有操作简便、分析快速、通用性强等特点，适用于冬虫夏草的产业化分析检测，为冬虫夏草质量评价提升提供了依据——论文作者：周妙霞1，庄诗诗1，李文庆1，汪小东1，杨丰庆2*，钱正明3*
