摘要:目的建立人血清不同形态碘的电感耦合等离子体质谱(inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)检测方法。方法四甲基氢氧化铵溶液稀释血清后，在氦气模式下建立碘的ICP-MS的检测方法，测定总碘。血清加入甲醇溶液沉淀蛋白质，上清经液相色谱分离后ICP-MS检测，测定无机碘。结果ICP-MS血清I-检出限为0.17μg/L，定量限为0.57μg/L，线性相关系数R2=0.9998;血清IO3-检出限为0.16μg/L，定量限为0.55μg/L，线性相关系数R2=0.9998。血清总碘测定方法的I-回收率96.2%～104.5%，无机碘测定方法的I-回收率93.7%～98.6%。对实际血清样品碘形态进行分析，I-含量2.6～12.2μg/L、有机碘含量45.3～66.0μg/L、血清样本基本不含IO3-。结论利用高效液相色谱串联电感耦合等离子体质谱建立了一种方便、高效、准确的碘形态分析方法，可测定血清碘形态及含量。
关键词:碘元素电感耦合等离子体质谱法碘形态分析
碘是人体必需的微量元素，是合成甲状腺激素必不可少的重要原料，其功能主要通过甲状腺素的生理作用显示，迄今尚未发现碘有除甲状腺素以外的其他独立生理作用。碘缺乏和过量均可损害健康，中国曾是世界上碘缺乏病分布广泛、病情较严重的国家之一，20世纪90年代实施普遍食盐加碘(universalsaltiodization，USI)政策前，全国1778个县有碘缺乏病的流行，地方性甲状腺肿病人776万，典型的地方性克汀病患者18.8万[1]。普遍食盐加碘是我国防治碘缺乏病的基本国策，我国自1995年实施全民食盐加碘以来，在预防和控制碘缺乏病方面取得了十分显著的成绩[2]。
人体摄入的碘主要来源于含碘食物及加碘盐，我国加碘盐中的碘主要是碘酸钾(KIO3)。碘酸盐被食物还原或在肠道转变为碘化物后被吸收，在血液中游离至甲状腺被摄取[3]，在甲状腺存储的碘将被合成甲状腺激素以有机碘的形式存在，碘在体内发挥的生理作用与其具体形态有关。
当前碘元素的检测方法主要有比色法[4]、气相色谱法[5]、离子色谱法[6]、电感耦合等离子体质谱法[7](inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)以及国家行业标准WS/T107.1—2016推荐使用的砷铈催化分光光度法[8]，而大部分方法只能用于测定碘的总量，仅有ICP-MS法可用于分析样本中碘的形态，欧盟发布的碘检测方法标准即为ICP-MS法。ICP-MS技术将质谱仪快速灵敏的扫描优点与ICP的高温电离特性相结合[9]，几乎可以分析地球上的所有元素。本研究将建立高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)-电感耦合等离子质谱联用测定有机碘和碘离子的方法，并用以血清中碘元素形态分布的检测。
1材料与方法
1.1仪器和试剂
电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，8800，Agilent，美国);高效液相色谱仪(HPLC，1260，Agilent，美国)，台式冷冻高速离心机(5810R，Eppendorf，德国);超纯水系统(Milli-QElementA10，Millipore，德国)，万分之一电子天平(XR205SM-DR，Precisa，德国)。
碘酸钾(KIO3，10g，Aldrich，美国)，碘化钾(KI，5g，Aldrich，美国)，硝酸(Merck，德国)，四甲基氢氧化胺溶液(TMHA，25%，ANPEL，中国)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氢氧化钠(NaOH)、硫酸钠(Na2SO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)购自国药集团化学试剂有限公司，铟标准品(In，1000μg/mL，Agilent，美国)。
1.2样品预处理
1.2.1总碘取血清样品0.2mL，置于离心管中，用1%TMHA定容至10mL，涡旋混匀后待测。
1.2.2无机碘取血清样品0.2mL，加入0.8mL甲醇，震荡混匀，-20℃冷冻过夜，沉淀血浆中蛋白质。12000r/min离心15min，取全部上清液，用高效液相色谱流动相定容至1mL，待测。
1.2.3标准液配制分别准确称量KIO3和KI各0.0500g，超纯水定容至10mL，配制KIO3和KI储备液。分别取KIO3和KI储备液混合，1%TMHA(测总碘时)或流动相(测无机碘时)定容至10mL，配制混合标准溶液，使KIO3和KI的碘浓度均为1000mg/L。用1%TMHA或流动相稀释混合标准溶液，使得碘浓度为0、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100μg/L，分别用于总碘或无机碘的检测。
1.2.4内标溶液配制取100μL铟标准品溶液，超纯水定容至10mL，待上机检测。
1.3ICP-MS检测条件
1.3.1总碘ICP-MS测定样品采用碰撞池氦气模式，参数设置见表1，以铟(115In)作为内标，在线吸入内标溶液，测定样品中的总碘含量，样品之间以1%TMHA清洗系统。
1.3.2无机碘HPLC流动相为5.0mmol/LNaH2PO4、15.0mmol/LNa2SO4、5.0mmol/LEDTA-2Na(NaOH调至pH7.0)，流速1mL/min，色谱柱:铬形态分析专用柱(30mm×4.6mm，Agilent)，进样量10μL。ICP-MS测定样品采用碰撞池氦气模式，参数设置见表1，测定样品中的无机碘含量。
2结果
2.1无机碘的色谱分离
色谱条件下，IO3-和I-在5.5min内即可实现基线分离，分离色谱图见图1。IO3-保留时间为37s，I-保留时间为326s，两者峰型均良好，可通过峰面积积分进行定量分析。
2.2HPLC-ICP-MS检测IO3-、I-的线性范围和精密度
KIO3和KI的混合标准溶液在0.2～100μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数(R2)为0.9998。
取空白溶液重复检测10次计算相对标准偏差，3倍标准偏差为检出限，10倍标准偏差为定量限。ICP-MS检测I-的检出限为0.17μg/L，定量限为0.58μg/L;IO3-的检出限为0.16μg/L，定量限为0.55μg/L。取一个样品分别进行多次测定计算相对标准偏差，评估方法的精密度，结果见表2，结果均满足检测要求。
2.3碘形态分析方法的准确性
由于IO3-在血清中不稳定，易被还原，所以在血清基质中只对I-进行加标回收实验，验证总碘检测方法、无机碘形态检测方法的准确性。
2.3.1总碘0.2mL血清加入不同量的I-后1%TMHA定容至10mL，使加入的I-终浓度分别为0.5、2.0、10.0μg/L，ICP-MS测定原血清稀释样本和加标样本的I-含量，计算加标回收率。原血清稀释样品I-本底值为1.57μg/L，加标样品I-的测定结果分别为2.01、3.62和11.64μg/L，加标回收率分别为96.2%、103.2%、104.5%。
2.3.2无机碘0.2mL血清加入不同量的I-后加入0.8mL甲醇，沉淀蛋白后取全部上清，流动相定容至1mL，使加入的I-终浓度分别为2.0、5.0、10.0μg/L，ICP-MS测定原血清样本和加标样本的I-含量，计算加标回收率。原血清稀释样品I-本底值为1.21μg/L，加标样品I-的测定结果分别为3.15、5.90和11.07μg/L，加标回收率分别为96.8%、93.7%、98.6%。
2.4血清样品碘形态分析结果
对实际血清样品按照已建立的方法进行碘形态分析，结果见表3。检测的5个血清样本总碘含量为56.8～74.7μg/L、I-含量为2.6～12.2μg/L、基本不含IO3-(图2)，计算得出有机碘含量45.3～66.0μg/L，占血清总碘含量的78.78%～91.02%。
3讨论
人体内的碘主要来源于食物、空气和水等，摄入的无机碘经单纯扩散或主动转运后快速被胃肠吸收，大部分有机碘则需要经过降解释放出无机碘后，才可被吸收。机体根据自身需求，在甲状腺中利用Na/I转运系统从血液捕获碘离子，经过氧化、碘化、偶联、胞饮、酶解等过程，碘化物转变为T3、T4等有机形态后扩散到血液并被运输到组织器官中发挥生物功能。因此，只有被合成甲状腺激素的碘即有机碘才能发挥其实际功效，而血液中游离碘化物的利用率取决于个体的碘供给状况[10]，所以分别测定有机碘和无机碘的含量有助于评估个体的碘营养状况。
本研究首先建立了血清碘的ICP-MS测定方法，I-和IO3-的检出限均<0.2μg/L，显著低于经典方法砷铈催化分光光度法测定血清碘的检出限(5.13μg/L)[11]，同时也低于陈美珠等[12]的ICPMS测定血清碘的检出限(1.3μg/L)。ICP-MS检测的高灵敏度是血清碘形态分析方法建立的基础。
目前国内对于血清碘形态分析方法的研究较少，王媛等[13]建立了ICP-MS分析人血浆和尿液碘形态的方法，用阴离子色谱柱分离IO3-和I-，用尺寸排阻色谱柱分离有机碘和I-，检出限0.3、0.6ng/mL，灵敏度与本研究结果较接近，但IO3-和I-的分离需要20min，且尺寸排阻色谱分离有机碘峰型较差，定量误差较大。本研究中，采用常规ICP-MS法首先测定血清总碘，再利用铬形态分析专用柱经HPLC-ICP-MS分离测定经甲醇沉淀蛋白后的血清样品上清中的IO3-和I-，达到两次进样即可分析血清中有机碘、IO3-和I-的目的。样品去除蛋白质后，可以避免蛋白质与色谱柱填料的相互作用，保护色谱柱不被污染，并且仅需5min左右即可分离IO3-和I-，简洁快速实现血清碘形态分析。
利用建立的碘形态分析方法测定5个血清样本的总碘含量为56.8～74.7μg/L，符合由世界卫生组织、奎斯特诊断公司以及美国梅奥医学中心提供的电感耦合等离子体质谱法测定的正常成年人血清碘代谢指标的参考值范围(分别是45～90μg/L、52～109μg/L和40～92μg/L)[14]。无机碘中I-含量2.6～12.2μg/L、基本不含IO3-，由总碘和无机碘计算得出有机碘含量为45.3～66.0μg/L。有机碘含量波动范围较小，可能是USI政策实施后，中国居民碘营养状况基本处于适宜水平，且在甲状腺内有一定量的储备，因此，血液中可发挥生理作用的有机碘含量基本稳定。而血液中无机碘与个体近期碘膳食摄入状况相关性较高，因此波动范围较大，碘形态分析方法的建立将有助于对个体碘营养状况进行评估。
本研究建立了一种基于HPLC-ICP-MS的血清碘形态分析及定量检测方法，尤其是无机碘的分析检测方面提供了一种简便的前处理方法，以甲醇沉淀血清中的蛋白质，去除与蛋白质结合的有机碘，上清经有效分离IO3-和I-后ICP-MS定量检测。本方法适用于碘形态的快速检测，也可为未来临床、实验室检测人体碘营养状况提供参考。——论文作者：于微1谭洪兴1王俊1刘小兵2杨丽琛2刘小立1杨晓光2
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