摘要合成了磁性富勒烯(Fe3O4@SiO2@C60)，考察了其作为固相萃取吸附剂对菊花中农药的萃取富集性能，建立了超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)同时测定可食用菊花中9种农药(嘧菌环胺、苯酰菌胺、唑虫酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、哒螨灵、辛硫磷)的分析方法。结果表明，Fe3O4@SiO2@C60对这9种农药有明显的吸附作用。考察了磁性分散固相萃取的影响因素，得到最佳的萃取和洗脱条件:以30.0mgFe3O4@SiO2@C60作为吸附剂，振荡萃取20min，磁性分离，加1mL乙酸乙酯洗脱液解析并重复2次。制备的Fe3O4@SiO2@C60材料具有良好的稳定性和可重复利用性。在0.005～0.1mg/L范围内，9种目标农药呈现良好的线性关系，线性相关系数大于0.999。方法检出限在0.001～0.003mg/kg之间，定量限在0.003～0.01mg/kg之间。当添加水平为0.01、0.05和0.10mg/kg时，回收率在71.0%～94.6%之间，相对标准偏差(n=6)在4.6%～11.3%之间。本方法操作简单、灵敏度高、分析速度快、成本低，适用于菊花中上述9种农药的定性与定量测定。
关键词磁性富勒烯;分散固相萃取;液相色谱-串联质谱;农药残留;菊花
菊花含有多种氨基酸、维生素、微量元素及菊花甙、胆碱、腺嘌呤等有效成分[1]，不仅具有观赏价值，还具有药用、饮用和食用等经济价值，而其农药残留问题也逐渐引起关注[2-3]。目前，我国涉及菊花中农药残留的相关限量标准较少[4-5]，GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对鲜菊花及干菊花中吡虫啉、井冈霉素制定了限量标准，为1～2mg/kg，这也是食品安全国家标准首次对代用茶制定农药残留限量[6]。2020版中国药典对药材及饮片中内吸磷等33种禁用农药及其代谢物进行了规定[7]。相对于此，欧盟针对花卉中农药残留设定的最大残留限量(MRL)则严格许多，共涉及农药500余种，对MRL值未进行评估的农药均实行0.01mg/kg的一律限量[8]。开发菊花中多种农药残留的高效、快速检测技术，对可食用菊花农药残留水平风险监测、质量控制及进出口产品监管等均具有重要意义
菊花基质复杂，含有色素、有机酸等复杂化学成分，与残留目标化合物的含量相差悬殊，其农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术。周红英等[9]采用乙腈提取，经Carb/PSA双层固相萃取柱净化、气相色谱结合FPD检测器测定菊花中氧乐果、敌敌畏、甲基对硫磷、甲拌磷、内吸磷和对硫磷6种有机磷农药残留量，检出限达到0.53～1.16μg/kg，回收率在78.5%～94.3%之间，相对标准偏差(RSD)为1.7%～5.9%。韩梅等[10]建立了一种加速溶剂萃取结合气相色谱-串联质谱法同时检测菊花中123种农药残留的方法。样品采用乙腈提取，经加速溶剂萃取，石墨化碳/氨基固相萃取小柱净化，气相色谱串联质谱多反应监测模式测定，方法提取效率高、准确、灵敏。将传统固相萃取方法应用于菊花中农药的多残留检测分析，虽然净化效果好，但目标物富集效率受样品过柱速度影响较大，存在整体过柱耗时长、有机溶剂消耗大、时间长以及前处理步骤繁琐等缺点，不利于大批量样品的快速前处理。
碳基材料如富勒烯(C60)、碳纳米管、石墨烯和介孔碳材料等，具有比表面积大、物理吸附性强、机械稳定性和热稳定性高等优点。碳纳米管、石墨烯等碳纳米材料，对弱极性小分子农残的分离富集具有极大优势[11-12]。如石墨烯及其复合材料作为固相萃取和固相微萃取的吸附剂，具有苄基、萘基和嘧啶基的农药易与石墨烯形成π-π堆积。Shi等[13]利用这一性质对含有该类官能团的6种氨基甲酸酯类农药进行富集，经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，回收率在81.1%～111.0%之间;Han等[14]以石墨烯为填料，制备固相萃取柱净化苹果汁中的有机磷，回收率为69.8%～106.2%。Deng等[15]制备了磁性多壁碳纳米管(MWCNTs)，将其作为吸附剂结合气质联用仪建立了茶叶中异丙威、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷、倍硫磷、硫丹、DDT和林丹的测定方法，回收率在72.50%～109.1%之间。张帆等[16]建立了MWCNTs为吸附剂的固相萃取净化/超高效液相色谱-串联质谱检测茶油中12种氨基甲酸酯类农药残留的快速分析方法，样品经乙腈超声提取，MWCNTs固相萃取小柱净化，农药的平均回收率为78.3%～116.0%。相对而言，C60在农残残检测方面的报道则较少。C60作为一种碳基纳米材料，由于C原子采用sp2杂化，具有较强的亲电能力，表现出缺电子多烯性质，并且π电子分布在C60三十二面体笼状结构的内外表面，形成三维共轭体系，与芳香化合物有较强的π-π共扼作用[17]。C60在空气中稳定，在多种有机溶剂中溶解度小，热稳定性好。与碳纳米管和石墨烯等碳纳米材料类似，C60具有较大比表面积和很强的疏水性，易于进行功能化修饰，同时还具有很好的耐酸、耐碱、耐热性能和化学稳定性，这些特点决定了富勒烯具有较好的选择性和较大的吸附量，在农残萃取领域具有良好的应用潜力。四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子具有超顺磁性[18]，通过与碳纳米材料构建磁性复合材料，将碳基纳米材料的强吸附性能与Fe3O4纳米粒子便捷的磁性分离能力相结合，建立磁分散固相萃取方法，可有效应用于农药残留[19-22]、抗生素残留[23-24]和有机污染物残留[25-27]等的富集净化。由于磁性吸附剂材料分散在溶液中，使得样品和磁性吸附剂之间的接触面积更充足，质量转移更快速，可快速达到平衡。整个萃取过程只需使用少量吸附剂和较短的平衡时间，即可实现萃取分离，省略了离心、过滤等前处理步骤，具有较高的萃取效率。另外，磁性碳纳米材料具有化学惰性和抗化学腐蚀等优点，经适当处理，可多次循环使用。
本研究合成了磁性富勒烯(Fe3O4@SiO2@C60)，考察了其作为固相萃取吸附剂对菊花中多种农药残留的萃取富集性能。参考菊花中农药残留相关文献报道[2-3]，本研究选取20种农药，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、新烟碱类、甲氧基丙烯酸酯类等类别，通过萃取富集效果对比及条件优化，结合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱技术，建立了食用菊花中多种农药污染物磁固相萃取-液相色谱-质谱分析方法。针对样品中不同类别农药，采用加水浸泡、乙腈均质提取，再将提取液以水稀释，以Fe3O4@SiO2@C60作为吸附剂萃取富集、磁性分离，采用乙酸乙酯洗脱，液相色谱-串联质谱技术检测。本方法操作简单、灵敏度高、分析速度快，适用于菊花中嘧菌环胺、苯酰菌胺、唑虫酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、哒螨灵和辛硫磷共9种农药的定性与定量测定。
1实验部分
1.1仪器与试剂
1290-6460超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司);N-EVAP112氮吹浓缩仪(美国Organomation公司);Vortex-Genie2涡旋混匀器(美国ScientificIndustries公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。
富勒烯(苏州大德碳纳米科技有限公司);正硅酸四乙酯、三氯丙基三甲氧基硅烷(瑞士Adamas公司);甲醇、甲苯、乙腈、正己烷、丙酮(色谱纯，美国TEDIA公司);FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、异丙醇、乙醇、三乙胺(分析纯，国药集团有限公司);内吸磷(Demeton-S)、氯唑磷(Isazophos)、硫线磷(Cadusafos)、辛硫磷(Phoxim)、克百威(Carbofuran)、杀线威(Oxamyl)、甲萘威(Carbaryl)、霜霉威(Propamocarb)、吡虫啉(Imidacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinotefuran)、嘧菌环胺(Cyprodinil)、苯酰菌胺(Zoxamide)、唑虫酰胺(Tolfenpyrad)、嘧菌酯Azoxystrobin)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、唑螨酯(Fenpyroximate)和哒螨灵(Pyridaben)标准物质(纯度≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司);实验所用水均为Milli-Q超纯水仪制备的超纯水(18.2MΩ·cm);0.22μm有机滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)。
1.2实验方法
1.2.1Fe3O4@SiO2@C60的制备
参考文献[27]方法制备Fe3O4@SiO2@C60磁性材料，制备路线如图1所示。首先取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，通过共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子，以正硅酸四乙酯包覆Fe3O4形成Fe3O4@SiO2，再以3-氯丙基三甲氧基硅烷修饰Fe3O4@SiO2，得到Fe3O4@SiO2@Cl纳米粒子。将C60、苯甲醛和苄胺溶于邻二氯苯中，反应后制得2，5-二苯基富勒烯吡咯啉，再与Fe3O4@SiO2@Cl纳米粒子反应，最终得到Fe3O4@SiO2@C60纳米粒子。
1.2.2标准溶液的配制
准确称取上述标准品10mg(精确至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，于4℃避光保存。
1.2.3菊花样品前处理
称取2g(精确至0.01g)菊花样品于50mL塑料离心管中，加入2mL水浸泡10min。加入18mL乙腈，于高速组织捣碎机上以15000r/min匀浆提取1min。以10000r/min离心5min，吸取1mL上清液于15mL尖底离心管中，加入9mL超纯水，混匀，再加入30mgFe3O4@SiO2@C60磁性吸附剂，振荡萃取20min。磁性分离，吸附剂加入1mL乙酸乙酯溶液，涡旋1min进行解吸，磁性分离后，将清液转移到新的离心管中。重复解吸操作2次，合并所有解吸液，氮气吹干，随后用1mL初始流动相溶解，过0.22μm有机相滤膜，供UHPLC-MS/MS分析。
1.2.4仪器分析条件
液相色谱条件:安捷伦ZORBAXEclipsePlusC18柱(50mm×2.1mm，1.8μm);流动相A为0.05%(V/V)甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序:0～0.3min，5%B;0.3～2.5min，5%～40%B;2.5～6.5min，40%～80%B;6.5～8.5min，80%B;8.5～10min，5%B。流速:0.3mL/min;柱温:40℃;进样量10μL。
质谱条件:离子源:电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，离子源温度300℃，电喷雾电压4000V，雾化气压力0.28MPa，干燥气温度300℃，干燥气流速10L/min，毛细管电压3000V。多反应监测模式(Multiplereactionmonitoring，MRM)，定性离子对、定量离子对、碎裂电压(FP)及碰撞气能量(CE)见表1。
2结果与讨论
2.1磁性富勒烯的制备及表征
通过共沉淀法合成磁性Fe3O4纳米粒子，再以正硅酸四乙酯包覆Fe3O4形成Fe3O4@SiO2，由于SiO2层的空间位阻作用，有利于颗粒分散，避免Fe3O4磁性颗粒团聚。以3-氯丙基三甲氧基硅烷修饰Fe3O4@SiO2得到Fe3O4@SiO2@Cl纳米粒子，再与富勒烯衍生物2，5-二苯基富勒烯吡咯啉反应，制得Fe3O4@SiO2@C60纳米粒子，保留Fe3O4的磁性效应，同时使外表面具备C60的吸附效应。通过透射电镜(TEM)对材料进行形貌表征，结果见图2。Fe3O4为准球形形状，平均尺寸约20nm。Fe3O4@SiO2因包裹了一层硅胶，平均粒径约100nm，Fe3O4@SiO2@C60因表面覆盖了一层C60，比Fe3O4@SiO2尺寸略大。将合成的磁性Fe3O4@SiO2@C60均匀分散于水中，外加磁场后Fe3O4@SiO2@C60会迅速聚集，具有良好的磁响应能力。
2.2材料的农药萃取性能测试
图39种农药的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析谱图Fig.3Ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometric(UHPLC-MS/MS)analysisof9targetpesticides将20mgFe3O4@SiO2@C60磁性材料加入1mL浓度均为0.05mg/L的20种农药混合标准溶液中30min，考察Fe3O4@SiO2@C60磁性材料对不同农药的吸附性能，结果表明，Fe3O4@SiO2@C60对嘧菌环胺、苯酰菌胺、唑虫酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、哒螨灵和辛硫磷吸附作用明显，但对内吸磷、氯唑磷、硫线磷、克百威、杀线威、甲萘威、霜霉威、吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉和呋虫胺吸附效果较差。通过对所选取的农药结构进行分析，推测可能是由于嘧菌环胺、苯酰菌胺、唑虫酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、哒螨灵和辛硫磷均具有苯环结构，有利于与Fe3O4@SiO2@C60中的富勒烯形成π-π共轭体系[28]，从而促进磁性材料对相应农药的吸附。内吸磷、氯唑磷、硫线磷与辛硫磷均为有机磷类农药，但前3种农药结构中不含苯环结构，采用Fe3O4@SiO2@C60进行萃取富集时效果较差，也说明Fe3O4@SiO2@C60对农药的富集效果主要基于π-π共轭效应。筛选嘧菌环胺、苯酰菌胺、唑虫酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、哒螨灵和辛硫磷等9种农药作为目标检测物，进一步优化实验条件。9种目标农药的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱色谱图如图3所示。
2.3磁性固相萃取条件的确定
2.3.1吸附动力学研究
萃取时间是影响萃取效率的重要因素。考察了不同萃取时间(5～35min)Fe3O4@SiO2@C60对嘧菌环胺、苯酰菌胺、唑虫酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、哒螨灵和辛硫磷等9种农药的萃取吸附效果。如图4所示，随着振荡时间延长，各组分的萃取回收率增加，20min后，萃取回收率均趋于平衡，相对于传统固相萃取方法，采用Fe3O4@SiO2@C60富集更高效、快速。
2.3.2吸附剂用量对吸附效果的影响
在空白样品提取液中加入混合标准农药标准溶液，固定每种农药的浓度为0.1mg/L，考察了Fe3O4@SiO2@C60用量对9种农药的萃取效果的影响。如图5所示，当Fe3O4@SiO2@C60用量为30mg时，各组分的吸附率趋于平衡，回收率高于80%。因此，选择Fe3O4@SiO2@C60的用量为30mg。
2.3.3样品溶液离子强度的影响
由于离子强度可能会对目标化合物的吸附热力学及吸附动力学产生影响，通过向样品溶液中添加不同浓度的NaCl(0～25%，w/V)，探究了离子强度对目标农药萃取效率的影响。结果表明，在考察的范围内，离子强度对9种目标分析物的萃取效率基本无影响，因此后续实验选择不加盐。
2.3.4洗脱剂的选择
分别以乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯作为洗脱剂，考察各有机溶剂对9种目标农药的洗脱效果。如图6所示，乙腈和甲醇对大部分目标农药的洗脱效果较差，而丙酮和乙酸乙酯对9种目标农药的洗脱效果相对更强，其中，乙酸乙酯的洗脱效果最好。根据“相似相溶”原理，农药组分洗脱效率与溶剂的极性相关，由Fe3O4@SiO2@C60萃取吸附的农药极性相对较弱，而乙腈和甲醇为极性溶剂，洗脱效果较差。因此，选取乙酸乙酯作为洗脱剂。
2.4Fe3O4@SiO2@C60的重复使用性
对于磁性材料，可重复使用性是一个重要的指标。将萃取使用后的Fe3O4@SiO2@C60用丙酮清洗2次，然后用去离子水清洗2次，真空干燥后，再次重复以上吸附实验。反复使用和再生10次后，Fe3O4@SiO2@C60对9种目标农药的萃取效率依然大于85%。这说明Fe3O4@SiO2@C60材料具有良好的耐用性，至少可重复使用10次。
2.5方法学考察
配制了系列浓度的混合标准溶液(0.005～0.1mg/L)，在最优化条件下进行实验和液相色谱-质谱检测，以9种目标农药的峰面积对质量浓度做工作曲线，9种农药的线性相关系数均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)确定定量限(LOQ)，9种目标农药的检出限在0.001～0.003mg/kg之间，定量限在0.003～0.01mg/kg之间，能够满足欧盟最低限量(0.01mg/kg)的检测需求。在不含9种目标农药的菊花样品中分别添加3个水平(0.01、0.05和0.10mg/kg)的样品，每个水平重复6次，结果见表2，9种目标农药的平均回收率在71.0%～94.6%之间，相对标准偏差(RSD)在4.6%～11.3%之间，准确度、精密度均符合食品理化检测要求，表明本方法具有良好的灵敏度和重现性，能够满足定量分析的基本要求。——论文作者：宋伟*1，2周典兵1，2郭春丽1韩芳1，2丁磊1，2吕亚宁1，2贾学颖1郑平1，2邓晓军3
相关期刊推荐：《分析化学》(月刊)1972年创刊，是分析化学学科专业性学术期刊。主要报道我国分析化学创新性研究成果，反映国内外分析化学学科前沿和进展。旨在为冶金、地质、化工、材料、农业、食品、药物、环境等领域从事研究测试的科技人员及高等院校相关专业的广大师生提供最新的分析化学的理论、方法和研究进展，促进学术交流和科技进步，为国家的经济建设服务。
