摘要:目的建立同时测定栀子厚朴汤中2个黄酮类成分(柚皮苷和新橙皮苷)含量的超快速液相色谱法分析方法。方法色谱柱采用Shim-PackXR-ODS柱(75mm×3.0mm，2.2μm)，流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～10min，20%B～30%B)，平衡时间设定为5min，流速设定为0.4mL/min，检测波长采用265nm，柱温设定为30℃，进样量设定为5μL。结果柚皮苷与新橙皮苷分别在3～150mg/L(r=0.9993)和1～50mg/L(r=0.9997)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.9%和99.1%。结论该方法结果准确、操作简便、具有良好的重现性和稳定性，可用于栀子厚朴汤的质量控制。
关键词:栀子厚朴汤;柚皮苷;新橙皮苷;超快速液相色谱法
栀子厚朴汤出自《伤寒论》，由栀子、厚朴、枳实三味药材组成，具有清热除烦、宽中消满的功效[1]。栀子厚朴汤中的化学成分主要包括环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、生物碱类、挥发油类等，具有抗抑郁、抗炎、抗焦虑、增加冠状动脉血流量、保肝利胆等多种生物活性，临床用于抑郁症、焦虑症、失眠症、传染性肝炎、胆囊炎等疾病的预防与治疗[2]。其中，柚皮苷和新橙皮苷是栀子厚朴汤组成药材枳实中含有的2个代表性黄酮类成分。药理学研究表明，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗骨质疏松等作用[3-4]，新橙皮苷具有抗抑郁、降低血糖和血脂等作用[5-6]。近年来，超快速液相色谱(ultra-fastliquidchromatography，UFLC)技术，相比于常规的高效液相色谱分析技术，具有分离度好、分析速度快、灵敏度高等优点，广泛应用于中药质量控制研究[7-8]。本研究采用UFLC技术同时测定栀子厚朴汤中的柚皮苷和新橙皮苷的含量，为栀子厚朴汤的质量控制和新药开发提供参考。
1、仪器与试药
超快速液相色谱仪(Prominence):日本岛津公司;冷冻干燥机(Scientz-12SN):宁波新芝生物科技股份有限公司;台式高速冷冻离心机(TG16KR):长沙东旺实验仪器有限公司;快速混匀器(XK96-A):江苏新康医疗器械有限公司;数控声波清洗器(KQ250DE):昆山市超声仪器有限公司;数字控温电热套(98-1-C):天津泰斯特仪器有限公司;旋转蒸发仪(R-3HB):瑞士布琪公司;电子天平(CPA225D):德国赛多利斯仪器有限公司。
HPLC级乙腈:美国Fisher科技;HPLC级甲醇:美国Fisher科技;HPLC级甲酸:国药集团化学试剂有限公司;屈臣氏纯净水:屈臣氏集团有限公司;柚皮苷对照品(纯度>98%，批号:110722-201815):中国食品药品检定研究院;新橙皮苷对照品(纯度>98%，批号:111857-201804):中国食品药品检定研究院。
栀子(产地:江西)、厚朴(产地:四川)和枳实(产地:湖南)药材购自吉林市吉林大药房。
2方法与结果
2.1样品制备方法及提取条件的选择
2.1.1对照品溶液的制备
取柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度分别为0.3g/L和0.1g/L的混合对照品溶液，备用。
2.1.2供试品溶液制备方法的优化与确定
首先对栀子厚朴汤冻干粉末的处理方法进行了考察，分别采用50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇考察冻干粉样品中2个黄酮类成分的提取率，结果100%甲醇提取效果最佳。其次，考察了不同超声时间对提取效果的影响。实验中对比了超声提取20、30、40min的提取效果，结果表明，超声提取30min提取效果最佳。最终确定供试品溶液的制备方法如下:
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称取栀子(9g)、厚朴(12g)和枳实(9g)，剪碎后加入到圆底烧瓶中，加水300mL，室温浸泡30min，回流提取1h，待溶液冷却后，采用5层纱布过滤，得到滤液;向圆底烧瓶中再加入300mL水，重复上述提取过程，获得滤液。合并两次获得的滤液，浓缩至50mL，将浓缩液冷冻干燥24h，制备栀子厚朴汤冻干粉，干燥器中保存备用。精密称取全方冻干粉末样品0.1g(相当于生药质量0.4g)，放在50mL锥形瓶中，加入25mL甲醇，超声处理30min，离心(13000r/min)10min，取上清液经微孔滤膜(0.22μm)过滤。取续滤液0.5mL，用甲醇定容至25mL，即得供试品溶液。
2.1.3阴性样品溶液的制备
称取栀子、厚朴药材，按“2.1.2”项下的方法处理，即得不含枳实的阴性样品溶液。
2.2色谱条件的优化与确定
2.2.1色谱条件的优化
本实验考察了2种不同的流动相体系(甲醇0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水)，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，各成分色谱峰峰形和分离度好，并能够缩短分析时间，最终选择乙腈-0.1%甲酸水为最终流动相。此外，考察了3种不同型号的色谱柱(ShimadzuShim-packGIST柱，4.6mm×250mm，5μm;ShimadzuShim-packGIST柱，2.1mm×100mm，2μm;Shim-PackXR-ODS柱，75mm×3.0mm，2.2μm)，结果表明，Shim-PackXR-ODS色谱柱的分离效果最佳。
2.2.2色谱条件的确定
色谱柱采用Shim-PackXR-ODS柱(75mm×3.0mm，2.2μm，SHIMADZU);流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱(0～10min，20%B～30%B)，平衡时间为5min，流速为0.4mL/min，柱温设置为30℃，进样量为5μL，检测波长为265nm。所得色谱图如图1所示。
2.3标准曲线的制备
取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，用甲醇配成系列混合对照品溶液(柚皮苷质量浓度分别为3、6、15、30、60、150mg/L;新橙皮苷质量浓度分别为1、2、5、10、20和50mg/L)，进样分析，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品的浓度(X，mg/L)为横坐标，柚皮苷和新橙皮苷的线性回归方程分别为:
Y=7.659×103X-1.729×104，r=0.9993
Y=1.617×104X-1.252×104，r=0.9997
2.4精密度实验
取混合对照品溶液(柚皮苷质量浓度:30mg/L;新橙皮苷质量浓度:10mg/L)5μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，柚皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.58%和0.47%，即仪器的精密度符合要求。
2.5稳定性实验
取同一份栀子厚朴汤冻干粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于样品放置0、2、4、8、12、24h后进行分析，柚皮苷与新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.34%和0.53%，即样品在24h内稳定。
2.6重复性实验
取同一批栀子厚朴汤冻干粉样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，柚皮苷和新橙皮苷的含量平均值(n=6)分别为10.98%和3.01%，RSD分别为2.4%和2.1%，表明方法重复性良好。
2.7回收率实验
取栀子厚朴汤冻干粉样品粉末9份，每份0.1g，加入相当于样品中柚皮苷和新橙皮苷含量的80%、100%、120%的对照品溶液适量，各3份，按“2.1.2”项下的方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件测定。柚皮苷和新橙皮苷的平均回收率分别为98.9%和99.1%，结果见表1。
2.8样品含量测定
精密称定6批次栀子厚朴汤冻干粉末样品，依次编号为2019001～2019006。制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算柚皮苷和新橙皮苷的含量(外标法)。6批样品测定结果见表2。
3讨论
通过对6个批次的栀子厚朴汤中柚皮苷和新橙皮苷的含量进行测定，结果表明:柚皮苷的含量不低于10.45%，新橙皮苷的含量不低于2.95%。由此可见，柚皮苷的含量要显著高于新橙皮苷。本研究建立了同时快速测定栀子厚朴汤中2个黄酮类成分(柚皮苷、新橙皮苷)含量的UFLC方法。该方法具有简单、快速的优点。查阅相关文献，沈震亚[9]建立了HPLC法同时测定了胃痛丸中柚皮苷和新橙皮苷的含量，分析时长为35min，本研究所建立的UFLC分析方法能够在7min内实现柚皮苷和新橙皮苷的快速分离与测定，大大缩短了分析时间，提高了分析效率，将有助于栀子厚朴汤的后续质量控制研究。
本研究选取栀子厚朴汤中的柚皮苷和新橙皮苷作为测定指标也有助于栀子厚朴汤的临床应用规范化和相关剂型的开发。随着现代仪器技术的不断提高和发展，未来UFLC技术将更多地应用到中药的现代化分析与检测中，将极大地推进中药的国际化和现代化发展。——论文作者：桑野，王开鼎，李海鹏，冯波，关皎*，朱鹤云*
