〔摘 要〕目的 依据GB/T19973.1-2015附录中的指南对医用脱脂棉生物负载的测定方法进行研究。方法 以袋蠕动法，采用0.9%氯化钠注射液将样品上的微生物最大化、最有效地重复洗脱下来，过程中均质器的洗脱参数设定为拍击频率6次/s，运行时间60s，然后采用薄膜过滤法对洗脱液进行过滤后，将滤膜移至胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养计数，计算回收率和修正系数。结果 在以上试验条件下，医用脱脂棉袋蠕动法重复洗脱2次后的回收率均大于80%，修正系数为1.20。结论 该试验方法明确了袋蠕动法重复洗脱的修正系数，适用于医用脱脂棉生物负载的测定。
〔关键词〕生物负载;医用脱脂棉;回收率;修正系数
生物负载指一件产品和(或)包装上或其中存活的微生物总数[1]。多年来，在医疗器械质量控制方面，针对灭菌前后、产品的微生物检验，通常将重点放在无菌检验上，而忽视了对产品生物负载的检测[2]。产品在灭菌前自然形成的生物负载(初始污染菌)的高低反映了生产环境的控制能力[3];若生物负载测定结果不准确，则不仅会影响灭菌参数的设定，还会影响产品质量，直接关系到产品最终的整体安全性能，同时可将其作为医用材料安全性评价的重要指标，甚至会涉及患者的人体安全;若生物负载水平增高，则会导致灭菌难度加大、灭菌不彻底、微生物的尸体过多，以及使用者出现炎症、发热等病理反应。由于医疗器械产品的种类繁多，因此，根据产品特性选择合适的生物负载检测方法非常重要。
医用脱脂棉作为被广泛应用的卫生材料，属于软质纤维材料，有很强的吸附性，且微生物对其表面的附着度较高;对于非无菌供应的医用脱脂棉，生物负载可以作为医疗单位灭菌时确定灭菌参数的重要依据。
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在医疗器械的微生物检验中，将法定的标准及方法作为参照十分重要[4]。YY/T0330-2015《医用脱脂棉》[5]4.14中指出，我们应按GB/T19973.1-2015《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》[1]规定的方法进行生物负载试验，但GB/T19973.1-2015中并未针对该产品给出具体的操作方法，附录中只有生物负载测定方法的设计要求及对所设计的方法进行确认的指南，基于此，本研究依据标准附录对医用脱脂棉的生物负载进行了方法学研究。
1 仪器与设备
高压蒸汽灭菌器(三洋电机国际贸易有限公司，MLS-3750型);生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司，BSC-1500ⅡB2-X型);微生物限度过滤系统(法国/默克，ZW-600型);无菌均质器(宁波新芝生物科技有限公司，SCIENTZ-04型);生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司，ZXSD-B1160型);低温生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司，ZXSP-A0160型);电子天平(德国赛多利斯，TE212-L型)。
2 材料与试剂
医用脱脂棉[邢台太行医用材料有限公司(批号：190106)，石家庄市宏运卫生材料厂(批号：20181108)，河北康济药械有限公司(批号：181218)];胰酪大豆胨琼脂培养基(北京陆桥技术股份有限公司，批号：180427);沙氏葡萄糖琼脂培养基(北京陆桥技术股份有限公司，批号：180912);0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，规格：500ml，批号：1802113204)。
3 修正系数的测定
依据GB/T19973.1-2015附录B.2.2.1袋蠕动法，在无菌环境下，取邢台太行医用材料有限公司样品5个包装，从每个包装中取样，准确量取3份样品，每份(1.0±0.1)g，放入无菌均质袋中分别作为样1、样2、样3，3份样品分别加入100ml0.9%氯化钠注射液至设定均质器的洗脱参数，推荐将洗脱参数设定为拍击频率6次/s，运行时间60s，启动均质器，使洗脱液贯穿试样内外，均质1min，然后取洗脱液进行薄膜过滤，将每份试样的洗脱液分别通过薄膜过滤等量、完全过滤到2张滤膜上，之后用100ml0.9%氯化钠注射液对每张滤膜进行冲洗(每份试样按上述方法共洗脱10次，其余两家的样品按照同法操作);将滤膜菌面朝上分别放置在胰酪大豆胨琼脂平板和沙氏葡萄糖琼脂平板上，将洗脱后的试样放置在空的平板中，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基进行琼脂覆盖，使胰酪大豆胨琼脂平板在30~35℃培养箱中培养3d、沙氏葡萄糖琼脂平板在20~25℃培养箱中培养5d，取出，观察计数。
依据表1~3的总CFU计算回收率，即洗脱1次的回收率为第1次洗脱的CFU与总CFU的百分比，洗脱2次的回收率为第1次洗脱的CFU与第2次洗脱的CFU之和与总CFU的百分比，见表4。
4 生物负载的计算
在无菌环境下，取待测样品5个包装，从每个包装中取样，准确量取3份样品，每份(1.0±0.1)g，分别作为样1、样2、样3;按修正系数测定所采用的方法，将待测样品的3个试样分别洗脱2次，先计算每个试样洗脱2次的菌落总数(M1、M2、M3)，然后计算M1+M2+M3的平均值M。
5 讨论
影响产品生物负载水平的因素有很多，总体而言，在进行生物负载测定时，我们应考虑到产品的生产环境、生产过程及特性等，为不同的步骤(取样→微生物采集→移至培养基、培养计数→确定修正系数→确定生物负载量)选择适当的方法。
本研究通过采用袋蠕动法将产品和一定体积的洗脱液装在一个无菌均质袋内，开启均质器，设定拍击频率为6次/s，运行时间为60s，使洗脱液贯穿样品的内外，最大化、最有效地将产品上的微生物重复洗脱下来，然后采用薄膜过滤法对洗脱液进行过滤后，将滤膜放至适宜的培养基上进行培养，并计数，之后通过修正系数对计数结果进行修订。本研究方法的关键在于如何最大化、最有效地将微生物洗脱下来，从而确定产品的生物负载，所以，我们需要根据产品的特性，选择合适的洗脱液、洗脱速率、洗脱时间。不同的洗脱液、不同的洗脱速率、不同的洗脱时间可能会导致微生物不被检测到或被破坏而导致其死亡，这些因素会造成微生物总检出率低、微生物种类丢失等，进而造成生物负载检测数据不准确，直接影响产品的质量控制[6]，因此，合理选择生物负载指标是确保产品质量指标符合产品风险管理要求的重要保证[7]。
由表1~3可知，样品洗脱2次后，CFU增加缓慢;由表4可知，样品洗脱2次后的回收率明显增高，且回收率均大于80%。产品的回收率越高，生物负载检测结果的准确度越高，但是，在实际检测过程中，不能一味地追求高回收率，还应综合考虑检测过程的便捷、高效，因此，本研究结合医用脱脂棉特性及实际检测过程，最终选择洗脱2次的平均回收率来确定修正系数，最后确定生物负载量。在方法未改变的前提下，我们可以利用已得到的修正系数计算结果，使检测方法得到简化[8];若回收率低于50%，则应考虑其他改进方法。——论文作者：康莉，李挥，刁立琴，付钊，高保栓，王志永，郭亚秋，冯毅(通信作者)
