摘要：为了解P限制水体中浮游植物群落对N、P营养盐的响应，通过添加N、P营养盐设置N/P梯度，对广东省流溪河水库中的浮游植物群落进行了研究。结果表明，添加N、P显著促进浮游植物的生长，浮游植物群落受P盐的影响比N盐显著;藻类的种属特异性导致浮游植物群落对氮磷营养盐的响应不一致，浮游植物总丰度与N/P比值不相关，其中隐球藻(Aphanocapsasp.)、拟柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)和假鱼腥藻(Pseudanabaenasp.)等蓝藻适合在高N高P条件下生长,双对栅藻(Scenedesmusbijuga)等绿藻优势种偏好中N高P环境，而曲壳藻(Achnanthessp.)、小环藻(Cyclotellasp.)等硅藻在低N低P的环境下占据优势;P浓度为0.8~2.0µmol/L时存在诱导浮游植物碱性磷酸酶活性的阈值，当P浓度大于2.0µmol/L时则抑制酶活性;P浓度为2.0µmol/L可能是浮游植物维持生长的最适浓度，浮游植物N/P维持动态平衡;藻细胞N/P、C/P与水体P浓度、N/P呈显著正相关，而藻细胞C/N受N影响更明显(P<0.05)。这为热带亚热带水库的水质管理提供了理论参考。
关键词：浮游植物群落;氮磷比;碱性磷酸酶;藻;元素
Redfield比值[1]是指养分不受限制时，藻类健康生长和生理平衡的元素比值关系为C/N/P=106/16/1。然而，许多研究[2–3]表明，有机体的化学计量C/N/P比值在不同的环境中存在差异。N和P是浮游植物生长所必需的营养元素，不仅绝对浓度能够影响藻类的生长，其比率(N/P)也直接影响藻类生长、细胞组成及其对营养的摄取效率。宋玉芝等[4]报道N/P为25时浮游藻类及附着植物的生物量随水体N浓度的升高而显著增加;Stockner等[5]报道，N/P比值从15提高到25时水体中的优势种从鱼腥藻(Anabaenasp.)逐渐发展为聚球藻(Synechococcussp.);纯种或混合培养体系中，N/P比不仅影响藻类的最大现存量，还影响藻类种间竞争的抑制参数、比生长速率等[6–7]。研究表明，在一定范围内，N/P的降低有利于甲藻占优势，高N/P(256/1)则对硅藻生长有明显促进作用[8]，而蓝藻水华更容易出现在低N/P下的超富营养水库中[9–10]。因此水体N、P供应及其比率影响着浮游植物种间竞争，对浮游植物群落的结构和演替有重要的决定作用[11]。
广东省地处热带亚热带北沿，区域季节性降雨较充足，水体常年温度较高，辐射较强，有助于浮游植物的全年生长，同时也提高了浮游植物对营养盐的需求[12]。然而，热带亚热带水库中磷酸盐长期维持在低浓度水平，P成为浮游植物生长的限制因子[13–15]。浮游植物在生长繁殖过程中可以通过调整其化学计量比(C/N/P)来改变生长速率，从而适应营养盐限制环境[16–17]，还能通过分泌胞内外碱性磷酸酶，通过裂解水体中的有机磷为无机磷[18],供自身生长所需;此外，一些水华藻类如拟柱胞藻[19]对低磷环境有着特殊的适应机制，能超额富集水体中较低浓度的P，这些特性使得这些水华蓝藻能够在P限制的水体中大量生长。本研究选取了一座典型低磷水平的南亚热带水库，其全年水体的平均N/P比接近90/1[20]，通过氮磷营养盐的添加试验来探究自然磷限制水体中浮游植物群落对不同氮磷比营养盐的响应。本研究从群落水平研究了营养盐的相对浓度对浮游植物的影响，为广东省热带亚热带水库的湖沼学研究和水质管理提供理论参考。
1材料和方法
1.1试验藻种来源和试验设计
2019年2月20日于广东省流溪河
水库取表层原水，经60µm滤网过滤浮游动物以及悬浮大颗粒物后，置于容量桶中带回实验室，测定原水的溶解态N浓度、溶解态P浓度、碱性磷酸酶活性(APA)、藻细胞C、N、P等指标作为初始值;原水为试验培养用水，原水中的浮游植物即为试验浮游植物群落的来源。取摇晃均匀的原水400mL分装于T175细胞培养瓶(TC-FlascheT175，Stand，Vent.Cap),为避免其他营养元素限制，事先已加入无N、P的WC培养基[21]。
基于经典的Redfield比值，即N/P比为16的阈值，我们认为该水库浮游植物主要受到P盐的限制，N盐十分充足。处理组N/P浓度的设置中N最低为原水本身的浓度，即N1浓度(41.1µmol/L)，N绝对浓度以20µmol/L为梯度增加，而P最低是高于原水的P3浓度(0.8µmol/L)，P绝对浓度以1.2µmol/L为梯度增加，共设计9组N/P处理组,1组空白对照(表1)。每组设3个平行,试验期间不再添加营养元素。培养条件：温度为(25±1)℃、光周期为12h/12h、光照强度为40µmol/(m2·s)，每天定时摇动藻液1次，随机移动藻瓶位置，避免光照不均匀。
1.2生长时期确定
隔天摇匀藻液，并移取于离心管中，用分光光度计在680nm波长下测定OD值，以天数为横坐标、OD值为纵坐标绘制浮游植物生长曲线来确定浮游植物生长时期，最终确定试验开始的第1天为初始期,第13天为指数期，第21天为稳定期。
1.3藻细胞胞内C、N、P含量测定
藻液过滤到酸化预处理后的玻璃纤维滤膜(WhatmanGF/C，孔径1.2μm)上，烘干储存于干燥器中。使用元素分析仪(型号VarioEL)进行C、N含量分析;藻细胞P含量采用钼酸铵分光光度法(GB11893-89)。
1.4碱性磷酸酶活性的测定
采用对硝基磷酸苯二钠法[22]测定水样碱性磷酸酶活性(APA)，反应条件为pH8.4、温度35℃、反应体积2mL、反应时间4h、测量波长410nm。依据对硝基苯酚的标准曲线，计算水解反应产生的对硝基苯酚的量。计算公式：APA=C/(T×V),式中，APA为碱性磷酸酶活性[nmol/(L·min)];C为对硝基苯酚的变化量(nmol)，即水解反应的产生对硝基苯酚量;T为水解反应的时间(min);V为测试水样的体积(L)。
相关期刊推荐：《热带亚热带植物学报》JournalofTropicalandSubtropicalBotany(双月刊)1992年创刊，优先报道热带亚热带地区植物学、生态学、环境科学及其交叉学科领域中的新发现、新理论、新方法和新技术,亦欢迎来自不同气候带的植物科学研究论文，重点刊登全球气候变化及生态系统服务功能、系统与进化生物学、环境退化与生态恢复、生物多样性保育及可持续利用、农业及食品质量安全与植物化学资源、植物种质创新与基因发掘利用以及能源植物的开发利用等方面的新成果。
水样不经过过滤测定的酶活性值为总的碱性磷酸酶活性(TAPA)，经WhatmanGF/C滤膜(孔径1.2μm)过滤后测定的酶活值为细菌+溶解性碱性磷酸酶活性(BAPA+DAPA)，则浮游植物的碱性磷酸酶活性为PAPA=TAPA-(BAPA+DAPA)。为校正因生物量的增加引起的总体活性增长，PAPA与生物量指标的比值即浮游植物单位生物量所表现的酶活性，也称作酶的特异性活性(specificactivity)，能更好地反映酶的内在催化效力[23]。本试验中，单位生物量酶活性(单位生物量APA)=PAPA/藻类总生物量，以nmol/(min·mg)表示。
1.5浮游植物的种类和定量分析采用Utermöhl计数法于倒置显微镜下对浮游植物进行分类鉴定和计数[24]，每个样品分别镜检多于400个浮游植物个体，其丰度计算公式为：N=(C×D2)/(V×n×d),式中，N为藻细胞丰度(cells/L)，V为沉降水样的体积(L)，D为载玻片直径(mm)，d为计数镜头直径(mm)，n为计数镜头数，C为计数细胞数(cells)。浮游植物种类鉴定主要参照《中国淡水藻类——系统、分类及生态》[25]和有关文献。根据浮游植物形态和大小计算各种浮游植物对应的生物量，本文选择粗分法进行生物量计算[26]。
1.6数据处理
运用IBMSPSSStatistics22S统计软件对数据进行显著性分析(One-WayANONA)，采用LSD法进行验后比较，差异显著性水平设为α=0.05，两个变量之间进行Pearson相关性分析。
2结果和分析
2.1浮游植物群落的组成
试验共观察到浮游植物6门72种(属)，其中绿藻门47种(属)、硅藻门10种(属)、蓝藻门9种(属)、甲藻门2种(属)、金藻门2种(属)、隐藻门2种(属)，浮游植物群落主要以蓝藻、绿藻和硅藻为主。原水浮游植物群落经培养后发生了变化(图1)。初始期原水中的浮游植物较少，总丰度为1.11×106cells/L,优势类群为硅藻门，占51.50%，其次为蓝藻门31.60%;指数期，浮游植物总丰度下降到0.89×106cells/L,而稳定期总丰度上升为1.23×106cells/L。指数期和稳定期群落主要以绿藻、硅藻为主，在稳定期金藻丰度明显上升。原水浮游植物总丰度先降低后升高，逐渐由硅、蓝藻转变为绿、硅藻为优势的群落结构。
添加N、P营养盐后，浮游植物总丰度均显著上升(图2)。指数期，浮游植物总丰度为2.93×107~1.22×108cells/L，以N2P1处理的丰度最高、N2P3的最低;在N1水平下，不同P浓度的浮游植物总丰度差异不大，而在N2、N3水平下，P1的总丰度显著高于P2，稍高于P3，表明N、P盐越高，浮游植物的生长越快。稳定期，浮游植物总丰度为3.33×107~1.19×108cells/L，N3P2处理的丰度最高，N2P2的最低，且大多组比指数期有明显上升，而N2P1、N2P2和N3P1总丰度降低，这可能是营养盐浓度较高促进浮游植物迅速生长，提前进入了衰亡期，导致丰度出现下降。Pearson相关分析表明，指数期、稳定期浮游植物总丰度与N/P比值的相关性不显著(P>0.05)。
不同营养条件下，浮游植物丰度组成有明显差异(图2)。指数期，在N1水平下，蓝、绿藻占比为P1>P2>P3，硅藻占比则相反，蓝、绿藻优势随P的增加更为明显;在N2水平下，蓝藻占比以P1>P2>P3，硅藻占比则相反，绿藻占比P2、P3均大于N1、N3水平下的P2、P3，表明相比于低、高N环境，中N水平下绿藻优势更大;在N3水平下,绿藻占比以P1>P2>P3，硅藻占比以P2>P3>P1,蓝藻占比均高于N1、N2水平的同P水平。稳定期,相同N水平下绿藻占比均为P1>P2>P3，硅藻占比则相反，而蓝藻在N3水平下均高于N1、N2水平下的各处理，与指数期一样，表明蓝藻在高N条件下的优势，而绿藻在高P下占比更大。
不同时期的蓝藻、绿藻和硅藻丰度存在差异(图3)。指数期时，同一N水平下，P1的蓝藻丰度明显高于P2、P3;同一P水平下，N3的蓝藻丰度高于N1、N2，但N2P1的丰度最高，这可能是误差造成的;同一N水平下，绿藻丰度以P1>P2>P3，同一P水平下，N2的绿藻丰度最高;N1水平下,硅藻丰度以P3>P2>P1，在N2、N3水平下则相反。稳定期时，不同N/P下藻类的丰度变化与指数期有差异，进入衰亡期的时间不同。综合可知，蓝藻在高N、P下的优势更明显，而绿藻在中N高P下生长更好;N、P浓度的升高，均能促进硅藻的生长,但优势上没有蓝、绿藻明显。
2.2浮游植物优势种的变化
不同营养条件下浮游植物优势种不同(图4)。指数期时，对照组优势种为小环藻，其次是微小四角藻(Teraëdronminimum)和锥囊藻(Dinobryonsp.);而处理组的优势种主要为曲壳藻、隐球藻和双对栅藻，在N1、N2水平下，曲壳藻占比以P3>P2>P1,在P2、P3为第1优势种，而P1的隐球藻占比超过曲壳藻成为第1优势种，小环藻远不及曲壳藻，双对栅藻则在N2水平有一定优势;在N3水平，P1和P3的第1优势种分别为假鱼腥藻和隐球藻，而P2的第1优势种为曲壳藻，其次为镰形纤维藻(Anki-strodesmusfalcatus)。稳定期时，对照组第1优势种为小环藻，其次为曲壳藻、锥囊藻;处理组的主要优势种为曲壳藻、假鱼腥藻和拟柱胞藻。曲壳藻占比与指数期相比有所上升，均呈P3>P2>P1，并以N2P3为最大，N1水平下曲壳藻均为第1优势种,在N2P3、N3P3下为第1优势种;N2水平下P1和P2的第1优势种分别为拟柱胞藻、假鱼腥藻，N3水平下第1优势种主要为假鱼腥藻，占比大于曲壳藻。
2.3浮游植物碱性磷酸酶活性的变化
原水中浮游植物在初始期具有较高的碱性磷酸酶活性(APA)，为2.17nmol/(min·mg)，到指数期和稳定期显著上升，分别为32.42和146.38nmol/(min·mg),且显著高于同时期处理组。指数期时，同一N水平下，P1和P2的APA明显低于P3，也低于初始期;稳定期时，同一N水平下，P3的APA高于P1和P2，而同一P水平下，N1的APA低于N2和N3。方差分析表明，APA与P浓度和N/P有显著相关性(P<0.05)，指数期APA与N/P的正线性相关较差，线性方程为y=0.0355x+0.5372(R2=0.3488)，稳定期两者的正线性相关极高，线性方程为y=0.3719x5.3566(R2=0.8901)(表2)。
2.4浮游植物元素化学计量值变化
初始期，浮游植物藻细胞的N/P、C/N和C/P分别为45±4、5±1和256±36，指数期与稳定期的细胞元素比值发生了明显变化(表3)。指数期，对照组藻细胞N/P和C/P均显著高于处理组，而藻细胞的C/N显著低于处理组;同一N水平下，藻细胞的N/P显示P3组>P2组>P1组，各处理间的差异显著(P<0.05);藻细胞的C/P在P3显著大于P2和P1，且P1与P2的差异不显著(P>0.05);同一P水平下，藻细胞C/N在N1显著大于N2和N3，N2与N3间差异不显著(P>0.05)。对浮游植物藻细胞元素计量值与N/P比值进行线性拟合(表2)，表明指数期的藻细胞N/P、C/P和C/N与水体N/P比值相关性不明显。
稳定期，对照藻细胞N/P显著高于各处理组,藻细胞C/N低于各处理组，而藻细胞C/P显著高于处理组中的所有P1、P2组，而低于P3组;同一N水平下，藻细胞N/P在P3组均显著大于P2、P1组,P1组与P2组差异不显著(P>0.05);不同处理组之间的藻细胞C/N差异不显著，均值为10±1。稳定期浮游植物元素各比值与N/P拟合线性相关,藻细胞N/P、C/P与N/P比值的正线性相关强，而藻细胞C/N与N/P比值不相关(R2=0.0016)。
试验中藻细胞C/N为4~15，较C/P的变化范围小，在Redfield值(6.6)附近变化;藻细胞C/P在稳定期差异较大，与P处理浓度表现出线性相关。指数期藻细胞N/P为7.65~26.85，稳定期为7.37~37.83。细胞内元素的组成对不同N和P处理水平的响应不同,藻细胞N/P、C/P均受P和N/P影响显著(P<0.01)，而藻细胞C/N受N处理影响更明显;在指数期，N和P处理的绝对浓度仅对细胞内N和P含量有显著的影响(P<0.01);在稳定期，N水平的绝对浓度对细胞元素含量没有显著影响，P处理的绝对浓度对细胞C、N和P的含量均有显著影响(P<0.01)(表4)。
3结论和讨论
3.1浮游植物群落结构对营养盐浓度的响应
南亚热带水库大多数为贫中营养型水体。在枯水期(11月-次年3月)，水体滞留时间短，水位波动较大，春季浮游植物群落中，以适应这种环境生长的硅藻占比最大[14]。本研究中水库水体以小环藻为优势藻，因为它们对P有较低半饱和浓度[15]，更适应自然的P限制环境，其次是以微囊藻为主的蓝藻。野外转移到室内，环境条件的变化导致部分不适应的藻类生长迟缓或停止，因此浮游植物的总丰度表现为初期急剧降低，到后期适应环境后上升。
与原水相比，添加N、P盐显著促进浮游植物的生长。然而，浮游植物总丰度与N/P比值(12~103)不相关，而与N、P的浓度有关，这表明水体N/P并不是影响藻细胞生长的唯一因素，而是应该结合N、P的绝对浓度来综合考虑[27–28]。水体N/P比能够指示水体中营养盐的不平衡以及对单个或多个藻种的N限制或P限制，但并不能指示群落所需营养情况。由于不同优势种对N、P浓度变化的响应不一致，即可能导致某种物种急剧上升，而其他物种急剧下降，这种补偿机制会掩盖群落总体丰度的变化，因而群落丰度与水体N/P比的相关性不明显。除了N、P营养物质外，光照、水温以及其他营养元素(铁、硅等)[29]都可能影响到浮游植物的生长，成为浮游植物生长的限制因子。
浮游植物对营养盐的变化和N/P比的响应具有种属特异性。本试验条件下，浮游植物群落对P盐的响应程度要比N盐显著。高N条件下浮游植物的生长并没有显著优于对照，一方面可能是热带亚热带水库浮游植物已对野外N充裕、P限制的环境有一定适应，另一方面是不同浮游植物利用营养盐的方式存在差异[30],对N、P浓度变化的响应程度不一致导致群落的总体响应有差异。无论在指数期或稳定期，蓝藻在高N(81.1mol/L)或高P(3.3mol/L)的营养条件下生长更好并占据优势。在稳定期时,高N组中蓝藻占据第1优势，但其丰度并不随P浓度升高而增加，这表明相对于P盐，蓝藻受N盐的影响更大。绿藻随P浓度的升高丰度增加,说明绿藻更喜好高P环境。另外，绿藻在N2浓度下的优势更大，与蓝藻喜好高N高P环境特性不同，绿藻更适合在中N高P的条件下生长。低P环境下硅藻相对有优势，高N低P的环境可以促进硅藻丰度增加，但在与蓝藻、绿藻的竞争的优势不明显，因而硅藻在N1浓度下占比更高。营养盐的比例主要通过影响物种间的竞争对浮游植物群落产生影响。因此，研究N/P比值对浮游植物的显著影响应固定在某一营养盐浓度下进行探讨更具有意义。
3.2优势种对不同营养盐的响应
水体中的N、P浓度及比值能显著影响水体中优势类群-硅藻的种类和丰度[30]。原水中硅藻门的小环藻属始终为第1优势种类，其次为金藻门的锥囊藻;指数期以微小四角藻为主的绿藻在磷酸盐的竞争中为次优势种，到了稳定期则被曲壳藻替代。小环藻优势随生长逐渐下降，而锥囊藻的优势升高。硅藻相对丰度的减少与其对硅酸盐的需求有关，此外，以锥囊藻为优势种的金藻大量生长也会消耗水体中的硅酸盐。与原水不同，同为硅藻优势种之一的曲壳藻是N、P处理的绝对优势种，可能是由于曲壳藻相比小环藻对水体硅的增加更为敏感[31]，添加N、P能促进曲壳藻吸收水体中的硅酸盐用于自身生长,但在高浓度下效果降低，因此低N低P条件下曲壳藻占据优势，这种优势在稳定期更为明显。
蓝藻优势种隐球藻在指数期高N高P下明显占据优势，在稳定期则被假鱼腥藻、拟柱胞藻替代。由于后期营养盐消耗降低，而假鱼腥藻和拟柱胞藻具有固氮特性[32–33]，在环境无机氮不足时可以进行固氮，从而满足生长要求，同时，还能够储存P以适应后期低营养盐环境，这些机制使得其能超越隐球藻成为稳定期的优势种之一。双对栅藻作为绿藻门的主要优势种，在N浓度为62.3µmol/L下有较好的生长优势，镰形纤维藻的适应范围较窄，仅在N浓度为81.1µmol/L、P浓度为2.0µmol/L时占据第1优势，到了稳定期更适应低营养盐环境的假鱼腥藻可以通过消耗储存在体内的P盐而继续生长;双对栅藻、卷曲纤维藻等绿藻优势度较低，说明在营养盐相对降低的条件蓝藻更占优势，生长后期一些绿藻竞争不过蓝藻[32]，这与周起超[34]的研究结果相似。——论文作者：潘静云1,杨阳2*,韩博平1
