摘 要：为了解鸡肺脏不同时期的免疫状态，本实验选择不同日龄的海兰白鸡的肺脏组织，利用免疫组织化学方法研究 MHC-Ⅱ+细胞的出现、定位分布及数量变化过程。结果显示，MHC-Ⅱ+细胞最初于胚胎13d出现。胚胎13d至18d期间，MHC-Ⅱ+细胞数量有所增多，并主要分布在三级支气管的肺房房间隔中。1日龄时，MHC-Ⅱ+细胞在小叶间结缔组织中也有分布。4日龄时，在初级支气管与次级支气管交汇处有淋巴细胞的聚集物，即形成了明显的支气管相关性淋巴组织(BALT)，此时 BALT 中的大多数细胞都表达 MHC-Ⅱ，成为主要的细胞群体。7至14日龄时，MHC-Ⅱ+细胞数量逐渐增加，在呼吸性毛细管管壁上出现较多的 MHC-Ⅱ+细胞。21至90日龄时，无论是 BALT 中，还是肺小叶中 MHC-Ⅱ+细胞的数量都持续增加，并且遍布于整个肺脏。结果表明，鸡肺脏中 MHC-Ⅱ+细胞的分布和数量均呈现日龄相关性变化，并且其变化可以反映出胚胎期及出壳初期肺脏中抗原呈递细胞较少，随后日龄显著增多，从而进行有效的抗原递呈，参与免疫应答。
关键词：鸡;肺脏;MHC-Ⅱ+细胞;抗原呈递细胞;分布
目前，家禽的呼吸道疾病如禽流感和新城疫等给家禽养殖业带来了巨大的损失，而肺脏又是家禽许多病毒性和细菌性疾病的主要靶器官，病原体会通过肺呼吸系统黏膜表面进入宿主，然后进一步散布到其他器官中。因此，动物的健康在很大程度上取决于是否能够成功控制病原在肺脏组织尤其是肺脏支气管黏膜表面的入侵和复制。抗原呈递细胞(Antigen-presentingcells，APC)是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给 T、B淋巴细胞的一类免疫细胞。研究表明，肺脏中的 APC 在肺免疫性疾病，如哮喘、特发性纤维化及病毒感染等疾病中具有重要的免疫学意义。主要组织相容性复 合 体 II类 分 子 (majorhistocompatibilitycom-plex-II，MHC-II)是免疫系统的重要组成部分，主要表达在抗原呈递细胞，如树突状细胞和巨噬细胞上，负责抗原递呈，在自我识别的机体系统中使特异性 T 淋巴细胞检测到外来抗原。因此，MHC-II分子是抗原呈递细胞膜表面的主要细胞识别标志。
孵化期间由蛋壳气孔过滤后的气体是禽类的氧气供应源。出壳之后，雏禽开始接触外界空气，并逐渐适应外界环境，同时其呼吸道结构和功能也得到发育和建立。出壳初期为了适应外界环境，鸡的肺脏也经历着相应的快速变化。伴随着肺脏结构和功能的一系列转变，肺脏的免疫功能也应发生着相应的变化，其中抗原呈递细胞的发育及呈递功能的发生至关重要，将决定是否能够及时并有效的产生免疫应答。因此本研究采用免疫组织化学方法研究从鸡胚到出壳后的不同生长发育阶段，肺脏中 MHC-II+细胞的发育情况以及定位分布变化，从而反映发育时期鸡肺脏的免疫状态变化，为进一步研究家禽肺脏的免疫机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验动物
200个海兰褐 SPF种蛋，购自吉林卓越生物科技有限 公 司。种 蛋 进 行 常 规 孵 化，雏 鸡 进 行 常 规饲养。
1.2 主要试剂及用具
冰冻切片用 OCT 组织包埋液购自美国 Sakura公司;小 鼠 抗 鸡 MHC-II 单 克 隆 抗 体 购 自 美 国SouthernBiotechnology 公 司;UltraSensitiveSP超敏试剂盒kit9901购自福州迈新公司。
相关知识推荐：畜牧兽医论文多少字数能发表
依爱 EIF/C.DME3456 孵化机/出雏机(广东依爱孵化机厂生产)，LeicaCM1850 冰冻切片机(德国 Leica公司生产)，OlympusCX41 显微镜(日本Olympus公司生产)，Pixerapro150ES图像采集器(美国 Pixera公司生产)。
1.3 试验设计
200个海兰褐 SPF种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别选择未经过疫苗免疫的11、13、15、18、20日胚龄鸡胚，1、4、7、14、21、35、56和90日龄的雏鸡，每个时期取3只鸡胚或雏鸡的肺脏组织。将肺脏组织制成冰冻切片，片厚5μm，于-80 ℃保存备用。
1.4 免疫组织化学染色程序
每张切片滴加30ml/L 过氧化氢，室温下孵育10min;PBS洗3次，每次3min;除去PBS，每张切片分别滴加小鼠抗鸡 MHC-II单克隆抗体工作液，37 ℃孵育1h;PBS洗3次，每次3min;每张切片滴加聚合物增强剂(试剂 A)，室温下孵育20min;PBS洗3次，每次3min;每张切片加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂 B)，室温下孵育30min;PBS洗3次，每次3min;DAB显色;苏木精复染;自来水冲洗返蓝;梯度酒精脱水;二甲苯透明;中性树脂封片;照相。
1.5 图像分析及统计学处理
应用Image-proplus6.0图像分析软件测定肺脏中单位视野内阳性细胞面积。每张切片测3个视野，取平均值。应用 SPSSl8.0软件对不同日龄的同一阳性细胞进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 胚胎期肺脏中 MHC-Ⅱ+细胞的分布规律
13日 胚 龄，MHC-Ⅱ + 细 胞 已 经 出 现 在 肺 脏中，由于此时肺脏的组织结构仍处于发育早期，很难辨别 MHC-Ⅱ+细胞分布的准确位置，似乎是出现在大的肺内导管-初级支气管或次级支气管周围(图1A)。
15日胚龄，各种免疫细胞中也只有 MHC-Ⅱ+细胞存在，而且数量明显增多，而且分布范围变广，较多地分布于由三级支气管管壁内陷所刚刚形成的肺房的房间隔中(图1B)。
18日胚龄与20日胚龄的发育状况相近，分布在房间隔上的 MHC-Ⅱ+细胞继续增多(图1C)。
2.2 出 壳 后 初 期 肺 脏 中 MHC-Ⅱ + 细 胞 的 分 布规律
1 日 龄 时，MHC-Ⅱ + 细 胞 数 量 继 续 增 多，MHC-Ⅱ+细胞除分布在房间隔上外，还在小叶间结缔组织中有分布(图1D)。
4日龄时，通过免疫组织化学染色可见，在初级支气管与次级支气管交汇处有淋巴细胞的聚集物，即形成了明显的支气管相关性淋巴组织(BALT)。从此时起，肺脏内的淋巴细胞就以两种形式存在，一是集合性淋巴组织—BALT，另外就是散布在肺小叶中的弥散性淋巴组织。此时 BALT 中的大多数细胞 都 表 达 MHC-Ⅱ，成 为 主 要 的 细 胞 群 体 (图1E)。除了形成 BALT 外，肺脏肺小叶中的各种免疫细胞的数量也较之前日龄明显增加，MHC-Ⅱ+细胞开始分布在三级支气管气道内壁中(图1F)。
7日龄时，BALT 更为发达，MHC-Ⅱ+细胞在房间隔和小叶间结缔组织中也有大量分布(图1G)。
14日龄时，呼吸性毛细管管壁上的出现较多的MHC-Ⅱ+细胞(图1H)。2.3 21-90 日 龄 肺 脏 中 MHC-Ⅱ + 细 胞 的 分 布规律
21日龄时，BALT 特别发达，其中 MHC-Ⅱ+细胞数量显著增加(图2)，而且除了BALT 中之外，MHC-Ⅱ+细胞已遍布全肺(图1I)。35日 龄 时，无 论 是 BALT 中，还 是 肺 小 叶 中MHC-Ⅱ+细胞的数量都持续增加(图1J，图2)。
56和90日龄时，MHC-Ⅱ+细胞的分布部位和数量与35日龄时基本一致，无明显变化(图1K，图1L，图2)。
3 讨论
在禽类养殖中，呼吸系统的疾病是影响养殖的疾病之一，给养殖业也带来了很大的经济损失。目前，对黏膜表面进行疫苗接种是阻止致病菌的入侵机体的主要方法，如滴鼻点眼和喷雾等接种方法。为了研制适合鸡使用且可以提供有效免疫保护的黏膜新型疫苗，就需要对鸡肺脏相关免疫系统的结构和功能的有综合的了解。但目前还缺乏有关鸡肺相关免疫系统的知识。
抗原呈递细胞尤其是树突状细胞是肺脏免疫微环境的重要组成部分和免疫前哨细胞，它与其它免疫活性细胞共同构成了肺脏的免疫屏障，具有免疫监视及诱导免疫应答反应的作用，同时也是特异性和非特异性免疫反应最重要的调节细胞。研究表明，大鼠肺脏树突状细胞在胚胎及出生时处于发育不完善状态，包括数量偏少，MHC-II分子表达过低，处理抗原提呈功能较弱等，与成年鼠的水平存在差距，这可能是幼鼠呼吸道抵抗力低下的重要因素。本研究发现，13 日胚龄时，MHC-Ⅱ + 细胞已经较早地出现在肺脏中，由于此时肺脏的组织结构仍处于发育早期，很难辨别 MHC-Ⅱ+细胞分布的准确位置，似乎是出现在大的肺内导管-初级支气管或次级支气管周围。随后胚胎期各日龄以及出壳后1日龄，MHC-Ⅱ+细胞数量随有所增加，但并不显著，这也在一定程度上证明鸡在胚胎期以及刚出壳时由于缺少抗原呈递细胞而导致呼吸道免疫力低下，容易受到病原菌的侵扰。——论文作者：张英楠1，2，张桂山1，徐 晶1，杨树宝1，3，*
