肝组织学检查不仅能够评价肝脏的炎症活动度和纤维化程度，还能够观察肝脏原位淋巴细胞、HBV特异T细胞等肝脏特有的免疫病理特征，以及肝细胞原位的HBV表面抗原、核心抗原的表达和亚细胞定位、共价闭合环状DNA(cccDNA)定量检测等病毒学特征。近年来，反映肝脏cccDNA水平和转录活性的新的血清学标志物和用于肝脏纤维化评估的血清学标志物、瞬时弹性成像(TE)等在慢性乙型肝炎(CHB)诊治中的应用越来越广泛。虽然这些非侵入性的检测指标和技术尚不能完全取代肝组织学检查，但可在一定程度上补充肝脏穿刺活检易受抽样误差影响和因侵入性不宜反复开展等缺点。本文将讨论和评述这些新指标、新技术在CHB患者管理中的应用，以及对肝脏固有免疫病理特征和病毒学特征等新认知的意义。
一、共价闭合环状DNA(cccDNA)的新血清替代物
清除或静默感染肝细胞核内的cccDNA对于CHB的临床治愈至关重要。接受核苷(酸)类似物(NA)治疗的患者，由于NA对病毒逆转录合成过程的强效抑制，血清HBVDNA很快就低于灵敏检测试剂的检测下限，但这并不代表cccDNA的消失。在HBeAg阴性或长期NA治疗的患者，血清HBsAg的主要来源不再是cccDNA而是整合的HBVDNA片段[1]，因此血清HBsAg定量不能完全代表cccDNA转录活性。需要寻找肝组织cccDNA的替代血清学指标。
HBV核心抗原相关抗原(HBcrAg)包括HBeAg、HBcAg和中间产物22kDa前核心蛋白(p22Cr)，因其能够反映含病毒核酸(rcDNA或病毒RNA)的丹颗粒、核衣壳空心的病毒颗粒和分泌HBeAg的总和而备受关注。无论是接受还是未接受NA治疗的患者，其血清HBcrAg水平均与肝内cccDNA相关[2]。血清HBVRNA来源于被包装在核衣壳内的前基因组RNA，以全长或截断的形式存在于患者血清中。在NA治疗过程中，cccDNA转录的前基因组RNA不能再被逆转录，而是积累并被组装释放[3]。HBVRNA水平的下降和消失或可预测HBeAg血清转换和NA停药后病毒反弹风险。一系列的研究表明，在众多的传统上被认为是“既往”感染者(血清仅anti-HBc单项阳性)的肝组织中可存在转录静默的cccDNA[4]，HBcrAg、HBVRNA等新的血清学指标无一能完全替代肝组织学不再活跃转录的cccDNA的存在。此时，核心抗体高水平阳性或许提示有cccDNA的存在。
二、肝脏组织的病毒学特征
HBV含有多种抗原包括包膜抗原(大蛋白、中蛋白、小蛋白)、HBeAg、HBcAg和HBxAg，肝组织原位染色对感染部位HBV抗原的定量和亚细胞定位非常重要。依据HBsAg(弥漫型、膜型、周边型、包涵体型及过渡型)与HBcAg(核型、浆型和膜型)的形态及分布可以判断病毒的复制活跃程度。例如，肝细胞内HBcAg的表达与HBV复制活跃和更高cccDNA含量呈正相关[5];HBcAg随着肝损伤的发生逐渐从细胞核再分布到细胞质中;HBV抗原的马赛克式分布形式可能反映出不同的病毒学/免疫学特征，如CHB患者特征性的毛玻璃样肝细胞，经免疫组化证实与HBsAg在肝细胞内的弥漫性分布有关[6]。虽然cccDNA新的血清学替代物HBVRNA和HBcrAg能够在一定程度上反映cccDNA的水平和转录活性，然而未来新研药物和新疗法对cccDNA作用的准确评估，以及整合HBVDNA的检测还需依赖于肝脏活组织检查。此外，探针原位杂交检测cccDNA、RNAscope技术检测HBVRNA等对功能性治愈的研究方面有很大意义，都值得通过组织学进行探索。
三、肝硬化的无创诊断指标及技术
在CHB患者中评判肝纤维化的血清学诊断指标，分为直接标志物和间接标志物两大类。建立在这些血清学指标上的肝纤维化诊断模型包括APRI、FIB-4和FibroTest等，其中FIB-4是一相对较好的肝硬化诊断模型。其计算公式为：FIB-4=年龄[年]×AST[U/L]/(PLT[109/L]×ALT[U/L])1/2。APRI和FIB-4一样难以鉴别不同阶段的肝纤维化，对于患有急性肝炎的患者可产生假阳性结果。FibroTest则纳入了2-巨球蛋白、结合珠蛋白、总胆红素、载脂蛋白A和γ-谷氨酰转肽酶等5个生化指标，再根据年龄和性别进行诊断模型的选择，测得FibroTest数值、判断肝纤维化程度。FibroTest对于显著肝纤维化的诊断具有重要意义。然而，由于相关生化指标的检测对实验室条件要求较高，限制了其在临床中的广泛使用。血清GP73测定是我国首先推出的肝硬化无创检测指标，对其介绍请参阅鲁凤民等[7]发表的血清GP73在肝纤维化诊断中的应用及其相关机制。
相关期刊推荐：《实用肝脏病杂志》以从事肝脏疾病基础和临床研究及防治的医务工作者为主要对象，报道各类肝脏疾病(包括各类肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌及其它肝脏疾病)的临床内外科诊疗实践经验和最新科研成果;介绍国内外本专业新技术、新疗法、新进展;探讨中西医结合治疗肝脏疾病的思路和方法;开展学术讨论。
TE根据超声传播速度推算出肝脏的硬度数值(LSM)，单位用kPa表示，是目前研究最为广泛的无创性诊断或评估纤维化程度的超声弹性成像技术。超声的传播速度与肝组织硬度呈正相关，速度越快，LSM越大，肝脏纤维化程度越严重。瞬时弹性成像的优势为操作简便、可重复性好，能够比较准确地识别出轻度肝纤维化和进展性肝纤维化或早期肝硬化。但其测定值易受肥胖、肝脏炎症坏死、胆汁淤积以及脂肪变等多种因素影响，在合并有活动性肝炎的情况下，肝脏硬度指数会随着ALT升高而升高，从而造成对肝纤维化程度评估的不准确。因此，TE不推荐用于转氨酶过度升高、特别是高胆红素的患者[8]。最后其他疾病如肝血管瘤、胆汁淤积以及肝脂肪变等均可以影响LSM值[9]。总的来说，大多数血清标志物诊断模型只在重度纤维化及肝硬化阶段敏感性较高，从肝纤维化诊断及分期角度考虑非侵入性成像技术优于血清学标志物及标志物诊断模型。尽管这些非侵入性操作在肝纤维化动态评估中有其优势，但因缺乏精准性，仍无法完全替代肝组织活检。
四、肝脏组织病理学特征
处于“免疫耐受”的HBeAg阳性慢性感染者与免疫激活的慢性肝炎患者(HBeAg+/-)尽管各有自己独特的生化和病毒学特征，但却可以有相似的肝纤维化病理改变。这与在长期的感染过程中，随着病毒复制水平与机体免疫反应状态不同，病变在静止与活动之间交替有关，最近的一项荟萃分析发现，在ALT仅有轻微的升高的患者中，肝组织学检查发现有高达50%的患者存在明显的纤维化[10]。由此可见，血清学检测并不能够完全反映真实的病理改变和疾病状态。纤维化是指肝细胞内有过多的胶原沉积，是慢性病毒性肝炎病变进展的一个重要特征。在临床实践中我们需要对炎症活动度和纤维化程度进行区分，其中分级主要反映肝内炎症活动度，以1～4级(G)表示;分期主要反映肝内纤维化程度，以1～4期(S)表示。目前常用的评估慢性乙肝疾病活动的组织学评分系统主要有Ishak和METAVIR系统。新的采用计算机辅助数字化图像分析测定肝组织胶原面积比例(CPA)能够定量评价肝纤维化程度，对纤维化程度更准确的判断，有助于更好地评价新治疗方案的疗效。
五、肝脏免疫学特征
尽管目前大多数有关HBV感染免疫应答的研究是通过血液样本开展的，但是肝脏的免疫学组分特别是固有免疫细胞组成明显不同于血液或其他淋巴和非淋巴器官[11]。肝脏除了提供HBV复制的实质细胞(肝细胞)外，还包含独特的非实质细胞类型，其中库普弗(Kupffer)细胞是人体内最大的巨噬细胞群，为肝脏组织所特有。肝脏中的NK细胞占所有肝内淋巴细胞的40%。此外，肝脏有选择性地富集使肝内淋巴细胞群与外周血存在明显差别。HBV特异性CD8T细胞在肝脏原位淋巴细胞中的占比明显高于血液，且这些CD8T主要是由记忆性T细胞构成。由于一些特殊的免疫细胞群体被完全隔离在肝脏内，使得肝组织活检在HBV免疫力评估中不可或缺。例如，在HBV感染的肝脏存在一种新型的组织原位记忆T细胞(TRM)，这些细胞不会进入血液循环。肝组织内的CD8TRM表达更少的颗粒酶，提示它们可能以非溶解细胞途径发挥抗病毒功能。在HBV清除后，具有TRM特性的HBV特异性CD8T细胞能够长期存在，这一现象或许能为未来实现慢性乙型肝炎的功能性治愈提供线索。在肝脏病理方面，肝损伤时CD4T细胞产生的白细胞介素(IL)-17主要在肝小叶和肝门脉区的积累，而肝坏死区的NK细胞的存在也提示其与HBV感染相关肝损伤有关。由此可见，肝组织学检查不仅能够将病理性肝损伤的组织化学染色与特异性免疫细胞分布分析相结合，还能联合评估病毒颗粒、免疫浸润和疾病病理学之间的关系，有助于了解HBV感染所致免疫病理变化。而选择性地分析肝组织原位特定免疫细胞及其亚群，将有助于了解新的治疗方案是否对肝脏内的NK细胞以及其他肝脏内特有的免疫细胞具有抗病毒免疫调节的潜力。
六、展望
尽管未来CHB的临床管理和免疫监测将主要以外周血样本为主，但由于组织学评估不仅能反映肝脏局部是否存在炎症及其活动度，同时还能反映持续炎症损伤累积所致的肝脏纤维化、肝硬化等组织学病变。所以组织学评估在指导慢性乙型肝炎临床管理、新药物和新疗法的评估中有不可或缺的意义。未来通过平行的血液检测和肝组织活检，可以更多地了解外周血和肝组织变化之间的关系，为新的抗病毒和免疫调节治疗方法提供重要线索。——论文作者：廖昊鲁凤民
