摘要:本研究采用邻苯二甲醛法从柏式中喙鲸(Mesoplodondensirostris)内脏中筛选出一株具高效降解胆固醇功能的乳酸菌HJ-S2，利用16SrDNA分子生物学和API50CH系统鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。为提高乳酸菌HJ-S2体外降胆固醇能力，考察了菌株的生长特性，并从培养基条件和发酵条件两个方面，采用单因素和正交试验进行工艺优化。优化后的培养基条件为:蛋白胨含量5g/L，葡萄糖含量25g/L，胆固醇含量1.0g/L，胆盐含量2.0g/L;发酵条件为:温度37℃，pH6，培养时间24h，接种量1%。在此优化条件下，胆固醇降解率达到69.81%，较优化前有显著提升，为功能性益生菌制剂的开发应用提供生产工艺及参考依据。
关键词:海洋生物学;植物乳杆菌;降胆固醇;喙鲸;发酵工艺优化
胆固醇在人体内具有重要的生理作用，是人体合成荷尔蒙以及组成神经细胞不可缺少的重要物质[1]，在体内可转化成类固醇激素、VD3及胆汁酸等物质。流行病学和临床研究表明，血清胆固醇水平和心脑血管疾病的发生呈明显正相关性，血清胆固醇水平每高出正常水平1mmol，导致心血管疾病的风险便增加约35%[2]。营养学家推荐食物胆固醇的摄入量为每人每天250～300mg，摄入过多会使血清中的胆固醇升高，诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病[3-4]。因此研究开发具有降胆固醇效果的药品、保健品及食品已成为当前的研究热点。
乳酸菌(LacticAcidBacteria，LAB)是指一群发酵糖类产生大量乳酸的细菌总称，是公认的安全微生物[5]。近些年的研究表明，定殖于肠道中的有益乳酸菌群具有多种保健作用:维持微生态平衡和肠道机能、降低血清胆固醇、缓解乳糖不耐症、改善肝功能、增强机体免疫功能及抗肿瘤等[6]。Oh等(2015)通过体外试验发现，从传统发酵的小米酒中分离所得乳酸菌有作为益生菌制剂用于发酵工业的潜在用途[7]。李昵等(2012)、蒲博等(2014)、丁苗等(2014)证实了乳酸菌在体内的降解胆固醇功能[8-10]。Zhang等(2016)对降低蛋黄胆固醇的复合乳酸菌剂(嗜热链球菌Streptococcusthermophilus、嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus、双歧杆菌Bifidobacterium)进行了工艺优化[11]。付永岩等(2019)优化了3株具降胆固醇能力乳酸菌的发酵培养基条件，为菌体高密度培养提供依据[12]。目前所报道的降胆固醇乳酸菌大多来自陆源，而海洋源乳酸菌则鲜有报道。
本研究对海平面300m以深海洋哺乳动物柏氏中喙鲸(Mesoplodondensirostris)内脏中的乳酸菌进行了降胆固醇活性筛选，并根据筛选所得菌株的生长特性及培养基条件、发酵条件两个方面采用正交实验优化各项技术参数，获得其对降胆固醇的优化条件，为海洋源功能性益生菌制剂的开发应用提供技术参考依据。
1材料与方法
1.1样品与试剂
样品取自2017年10月搁浅于福建省宁德蕉城区(三都澳青山海域)的柏式中喙鲸的肠道内含物。无菌操作取样后将样品送至本实验室-20℃冰箱保存备用。
蛋白胨购自生工生物工程(上海)有限公司;眎蛋白胨购自青岛海博生物技术有限公司;菊糖购自阿拉丁试剂有限公司;胰蛋白胨、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、胆固醇购自国药集团化学试剂有限公司;邻苯二甲醛购自麦克林试剂公司;可溶性淀粉、吐温80购自西陇化工股份有限公司;试剂均为国产分析纯。
1.2培养基
MRS培养基(1L):蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.2g、吐温801.0mL、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L。调节pH到6.4左右，121℃灭菌20min。
MRS-CHOL培养基(1L):在上述MRS培养基础上添加胆固醇1.0g，吐温8020mL，牛胆盐3.0g。将1.0g胆固醇置于20mL吐温80中，加热至沸腾后使其溶解，趁热缓慢倒入培养基中，呈胶束溶液状态，此时培养基的颜色呈不透明淡黄色。配制好的培养基在121℃灭菌20min后趁热将试管晃动或上下颠倒振荡，以使该胶状物完全溶解，置于室温中自然冷却，放置备用。
1.3实验方法
1.3.1菌株分离纯化及降胆固醇功能的筛选将样品混合适量无菌水研磨均匀，吸取1mL研磨液转移至装有含9.0mL0.9%灭菌生理盐水的试管中，振荡摇匀。从1×10-1到1×10-6进行梯度稀释并吸取0.15mL研磨稀释液涂布于MRS(含碳酸钙)平板上，置于恒温培养箱37℃厌氧培养36～72h。根据菌落的颜色、大小、光泽、透明程度等，挑取有透明圈的单菌落于MRS平板上进行多次划线纯化，记录菌落形态特征。将纯化菌株进行革兰氏染色、油镜和过氧化氢酶实验，凡是革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性的菌株疑似为乳酸菌。纯化后菌株接种于MRS斜面培养基上培养，4℃保存备用。
采用邻苯二甲醛法[13]对待测菌进行降胆固醇能力的筛选。将疑似乳酸菌连续活化2次后，按2%接种量接种到MRS-CHOL液体培养基中，37℃厌氧培养24h后取1mL发酵菌液，离心(8000r/min)10min后取上清液采用邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量，按公式(1)计算降胆固醇率，实验重复3次。
式(1)中:A0、A1分别为未接菌上清液和菌株发酵上清液的胆固醇质量含量(mg/mL)。
1.3.2菌株HJ-S2的分子鉴定挑取保存于平板上2～3个菌落混合于API50CH培养基中，制得浑浊度相当于2McFarland的菌悬浮液，将此菌悬浮液依次加入API50CH试剂条的孔中，用甘油覆盖保持厌氧环境，底盘加10mL水使其保持湿润的气体环境，随后将试剂条浮于水上，37℃培养48h观察各糖类发酵情况。结果经API-plus软件分析发酵糖种类确定其菌属。
采用试剂盒提取细菌DNA，并利用16SrDNA通用引物(27F，1492R)进行PCR扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳得到清晰的条带。菌株PCR产物送至上海生工有限公司测序，并将测序结果与GenBank各标准菌株序列进行BLAST比对，使用MEGA7.0软件构建系统发育进化树，完成乳酸菌的分子鉴定。
1.3.3菌株生长特性的测定取保存的菌种，在无菌条件下接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h后按2%的接种量连续活化两次，得乳酸菌菌悬液。将活化后的菌株HJ-S2按2%接种量接入500mLMRS液体培养基中，37℃摇床培养。测定初始培养基的OD600，前期10h每间隔1h测定培养液的OD600和pH值，后期每间隔3h测定培养液的OD600和pH值，连续测定48h，绘制菌株HJ-S2的生长曲线及pH值变化。
1.3.4培养基条件对胆固醇降解率的影响分别用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨以等量代替MRS-CHOL培养基的蛋白胨，将菌株HJ-S2按2%接种量接种于含不同氮源的MRS-CHOL培养基中，于37℃恒温摇床培养24h，按“1.2.1”的方法测定不同种类氮源对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响。选出确定的氮源后，进一步考察氮源添加量对降解率的影响。
分别用蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、菊糖代替MRS-CHOL培养基中的葡萄糖，测量方法同上，考察不同碳源及添加量对降解率的影响。
将菌株HJ-S2按2%接种量接种于含胆固醇含量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL的MRS-CHOL培养基中，37℃摇床培养24h，测定不同胆固醇含量对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响。
将菌株HJ-S2按2%接种量接种于含牛胆盐含量分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的MRSCHOL培养基中，37℃摇床培养24h，测定不同牛胆盐含量对HJ-S2胆固醇降解率的影响。
1.3.5不同发酵条件对胆固醇降解率的影响
以“1.3.4”实验中所确定的MRS-CHOL培养基的各成分含量，将活化后的菌株HJ-S2按2%接种量接种于MRS-CHOL培养基中，37℃恒温摇床培养54h，每6h取培养液，测定不同培养时间对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响。
菌株HJ-S2活化后按2%接种量接种于MRSCHOL培养基中，分别于37℃、38℃、40℃、41℃、42℃恒温摇床培养24h，测定不同培养温度对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响。
菌株HJ-S2接种于初始pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10的MRS-CHOL培养基中，37℃恒温摇床培养24h，测定不同初始pH对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响。
菌株HJ-S2按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量接种于MRS-CHOL培养基中，37℃恒温摇床培养24h，测定不同接种量对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响。
1.3.6培养基、发酵条件正交试验为了确定最佳的液体培养基配方，依据前期单因素条件对菌株HJ-S2胆固醇降解率影响的实验结果以及细菌生长所需营养要素的基本原则，以胆固醇降解率为指标，分别设计葡萄糖、蛋白胨、胆固醇、胆盐含量4因素3水平正交试验及pH、培养时间和接种量3因素3水平正交试验。
1.4数据统计分析
采用Excel2013软件分析数据，每个试验重复3次;采用统计学软件SPSS19.0软件进行差异显著性分析，当p<0.05时，差异被认为是有意义的，结果表示为平均值±标准差;采用Origin8.0和Excel2013进行绘图。
2结果与讨论
2.1乳酸菌的分离纯化及降胆固醇功能筛选
从喙鲸内脏共分离纯化出30个单菌落，生理生化实验及形态学观察结果显示，该30株菌为革兰氏阳性菌，菌落形态为透明、白色或黄色且边缘规则，油镜下观察菌体形态为球状或杆状，过氧化氢酶试验为阴性，符合乳酸菌属的特征。将所得乳酸菌进行降胆固醇能力筛选实验，其中降解率小于10%的有6株菌，10%～20%的有8株菌，>20%～30%的有8株菌，>30%～40%的有5株菌，40%以上的有3株菌(HJ-W33、HJ-W64、HJ-S2)，降解率分别为40.69%、40.78%、48.82%，其中HJ-S2(CGMCCNo:17720)的降解率最高为48.82%，具有较高的潜在研究价值(表1)。
2.2具降胆固醇功能乳酸菌的鉴定
对菌株HJ-S2进行API50CH碳水化合物发酵鉴定，将发酵结果(表2)输入API数据库进行比对分析，鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，后续为了使鉴定结果更精准，结合16SrDNA序列分析进行分子水平的鉴定。
菌株HJ-S2的PCR产物大小为1.5kb左右，符合16SrDNA序列长度。将扩增后的PCR产物测序结果与已知标准菌株序列进行同源性对比，BLAST结果显示该菌株的序列与登录号为LC379973.1、CP0237771.1以及MH779888.1等植物乳杆菌的16SrDNA基因组序列相似性均为100%，证实了菌株HJ-S2为植物乳杆菌L.plantarum(GenBank登录号MK248728)。使用MEGA7.0软件构建了其系统发育树，如图1所示。
2.3菌株的生长特性菌株
HJ-S2的生长特性如图2所示。前期0～3h是生长延滞期，该阶段菌株适应培养环境，繁殖缓慢，数量增长较少，OD600由0.25缓慢上升至0.38，pH值从初始培养基的6.10下降至5.63。3～24h是菌株生长对数期，该阶段细菌代谢和繁殖快速增长，生长迅速，细菌数呈对数式生长，OD600由0.38迅速上升至1.65，pH值迅速从5.63下降至3.72左右。24～34h为菌株生长的稳定期，其间活菌数达到最大值且基本保持不变，菌体代谢和繁殖平衡，代谢产物持续积累，OD600维持在1.65左右，此时酸性代谢产物趋于稳定，体系pH值稳定在3.70左右。34～48h是菌株的衰亡期，该阶段活菌数略有降低，部分菌株衰老死亡，且菌株活性降低并趋于停滞，OD600从1.65降至1.50左右且具持续缓慢降低的趋势，菌体的凋亡使部分酸性代谢产物减少，pH值略有回升，从3.70回升至3.90左右。由此可见，菌株HJ-S2生长速率较快且产酸能力强，适合发酵法制备功能性微生态制剂。
2.4不同氮源和碳源对胆固醇降解率的影响
考察不同氮源对胆固醇降解率的影响结果如图3(a)所示。同一菌株在含不同氮源的MRS-CHOL培养基中胆固醇降解率差异显著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以蛋白胨为氮源的培养基中胆固醇降解率最高，胰蛋白胨略低，眎蛋白胨较低，大豆蛋白胨最低。此外，蛋白胨价格也相对较低，综合考虑选择蛋白胨作为发酵氮源。进一步对考察不同蛋白胨添加量对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响，结果如图3(b)所示，氮源含量对菌株的胆固醇降解率有一定影响。当蛋白胨含量为10g/L，降解率最高，达到39.28%;当继续提高蛋白胨的添加量，降解率有所下降，维持在25.80%左右，由此确定正交试验水平为蛋白胨含量5、10、15g/L。
考察不同碳源对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响结果如图3(a)所示。菌株在含不同碳源的MRS-CHOL培养基中胆固醇降解率差异显著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以葡萄糖为碳源的培养基中胆固醇降解率最高，乳糖、麦芽糖、菊糖次之，而可溶性淀粉作为碳源时降解率最低。葡萄糖作为单糖，微生物能很好地直接吸收利用，因此选择葡萄糖作为发酵碳源。
进一步考察葡萄糖不同添加量对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响，结果图3(b)所示。当葡萄糖添加量为20g/L时，菌株HJ-S2对胆固醇的降解率最高，达到42.13%，当继续提高葡萄糖的添加量，降解率反而下降维持在29.30%左右。因为碳源含量过高使菌体生长过快，过早衰老发生自溶，从而影响菌体对胆固醇的吸收[14]。由此确定正交试验中葡萄糖含量为15、20、25g/L。
2.5胆固醇、胆盐含量对胆固醇降解率的影响
不同胆固醇含量对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响如图4(a)所示。菌株HJ-S2对胆固醇的降解率随胆固醇含量的升高先增大后减少，当胆固醇含量为1.0g/L时，降解率达到最大值为38.94%，随着胆固醇含量的增加，降解率略有降低，后续维持在26.13%左右。由此确定正交试验中胆固醇含量为0.5、1.0、1.5g/L。
不同胆盐含量对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响如图4(b)所示。菌株HJ-S2对胆固醇的降解率随胆盐含量升高先增大后减少，胆盐含量为1.0g/L时，胆固醇降解率较低为18.62%;当胆盐含量为2.0g/L时，降解率达到最大值为43.99%;胆盐含量达到3.0g/L时，胆固醇降解率达到了38.62%左右，随着胆盐含量的升高，胆固醇降解率也相应减小后续维持在37.51%左右。由此确定正交试验中胆盐含量为1.5、2.0、2.5g/L。
2.6发酵时间、培养温度对胆固醇降解率的影响
发酵时间对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响如图4(c)所示，结合菌株生长曲线进行分析，0～3h为菌株的生长延滞期，菌体适应培养环境，繁殖缓慢，数量增长较少，此阶段胆固醇降解率较低;3～24h为菌株的对数生长期，此阶段细菌数量呈指数增长，细菌代谢繁殖快速增长，培养基中胆固醇含量急剧下降，当培养到24h时，胆固醇降解率达到最大42.18%;24～34h为乳酸菌生长的稳定期，胆固醇降低率不再增加且略有下降;34～54h为菌株的衰亡期，部分菌体衰老死亡，胆固醇降低率逐渐稳定在32.15%左右。
不同培养温度对菌株HJ-S2胆固醇降解率的影响，结果如图4(d)所示。不同培养温度对菌株的降胆固醇能力有一定影响，当培养温度为34℃时，胆固醇降解率最低为25.82%左右;当温度为37℃时，菌株HJ-S2对胆固醇降解率最高达41.39%且与38℃时的降解率相差不大;温度达到40℃以上时，使菌体活性相应降低，影响菌体对胆固醇的吸收从而使胆固醇降解率稍有降低。因此后续实验一直在37℃进行分离培养，且菌体的最适温度为37℃，温度过低或过高都会影响菌体的生物活性。——论文作者：万婧倞，罗曼，吴鹏，黄仕新，唐旭*，徐长安
相关期刊推荐：《应用海洋学学报》(季刊)创刊于1982年，由国家海洋局第三海洋研究所、中国海洋学会、福建省海洋学会主办。本刊为全国性海洋科学学术期刊。主要刊载台湾海峡及其邻区海域(东海、南海)的物理海洋学、海洋化学、海洋环境学、海洋生物与水产学、海洋地质与地震学、海洋开发与管理等方面的学术论文和研究报告等。读者对象主要是国内外海洋生物、水产、化学、环保、水文、气象、港工、地质、地震等单位和部门的科技人员、管理人员、高等院校相应专业的师生等。
