[摘要]目的：探究白细胞介素(IL)-17在牙髓炎症过程中时空表达，研究IL-17对牙髓炎可能的调节机制。方法：构建大鼠牙髓炎模型，苏木精-伊红(HE)染色观察牙髓组织结构形态，免疫组织化学染色检测牙髓中IL-17表达;培养人牙髓细胞，肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α刺激模拟炎症状态，RT-qPCR检测IL-17基因表达，ELISA检测IL-17的蛋白表达;IL-17重组蛋白刺激牙髓细胞，RT-qPCR检测MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-13的表达，胶原酶谱和明胶酶谱检测MMP-1和MMP-2酶活性;Westernblot检测信号通路表达。结果：IL-17在牙髓炎症过程中持续高表达，体外TNF-α刺激可升高牙髓细胞IL-17的表达。IL-17刺激牙髓细胞，上调MMP-1和MMP-2的酶活性，并激活丝裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路。结论：IL-17在炎症牙髓表达上调，并可通过升高MMP-1和MMP-2的表达，激活MAPK信号通路发挥促炎作用。
[关键词]牙髓炎;白细胞介素-17;基质金属蛋白酶;免疫学
牙髓炎是口腔临床常见病。龋病、隐裂和牙体折裂等导致的细菌感染牙髓均可引起牙髓炎。急性牙髓炎发作可致使剧烈疼痛，如未能及时治疗，可进一步发展为牙髓坏死和根尖周炎，严重时甚至危及生命[1]。牙髓炎症中，侵入的细菌及其代谢产物可以刺激牙髓中的免疫细胞与非免疫细胞产生大量炎性因子和趋化因子。这些因子与多种细胞相互作用形成一系列复杂的调控网络[2]。
白细胞介素(interleukin，IL)家族在炎症和多种感染性疾病中起到重要作用，其中IL-17在近期的研究中受到广泛关注。IL-17在多种感染性疾病中高表达，具有抗感染和促炎的双重作用[3]，同时在自身免疫性疾病中也是关键的促炎因子[4]。IL-17不仅参与了全身炎性疾病，而且在牙周炎、牙髓炎、根尖周炎，以及扁平苔藓等口腔疾病中也发挥炎症调节的作用[5-8]。尽管已有研究提示IL-17在牙髓炎中高表达[8]，但是目前对IL-17在牙髓炎症中的作用机制还缺乏深入研究。
基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)与细胞外基质的降解和改建密切相关，并协 白细胞介素(interleukin，IL)家族在炎症和多种感染性疾病中起到重要作用，其中IL-17在近期的研究中受到广泛关注。IL-17在多种感染性疾病中高表达，具有抗感染和促炎的双重作用[3]，同时在自身免疫性疾病中也是关键的促炎因子[4]。IL-17不仅参与了全身炎性疾病，而且在牙周炎、牙髓炎、根尖周炎，以及扁平苔藓等口腔疾病中也发挥炎症调节的作用[5-8]。尽管已有研究提示IL-17在牙髓炎中高表达[8]，但是目前对IL-17在牙髓炎症中的作用机制还缺乏深入研究。
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同多种促炎因子和趋化因子调节炎症和免疫反应[9]。牙髓炎常常伴有牙髓组织降解和破坏，然而目前尚缺乏研究探索牙髓炎症中IL-17与MMP之间的联系，因此在本研究中主要研究IL-17在牙髓炎症中的表达和对MMP的作用，并探索IL-17促进炎症的可能机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞来源牙髓细胞由年龄为18～22岁，因正畸需要拔除的完整正前磨牙或第三恒磨牙，无菌条件下获取其中牙髓细胞进行体外原代培养获得。所有操作均经患者知情同意。
1.1.2试剂鼠尾胶原及明胶(Sigma，美国);重组人IL-17蛋白(R&D，美国);IL-17ELISA检测试剂盒(Cloudclone，美国);兔抗人p65抗体(CST，美国);兔抗人磷酸化p65抗体(CST，美国);兔抗人p38抗体(CST，美国);兔抗人磷酸化p38抗体(CST，美国);兔抗人Erk抗体(CST，美国);兔抗人磷酸化Erk抗体(CST，美国);兔抗人α-tubulin抗体(Abcam，美国);磷酸盐缓冲液(中杉金桥，中国);高糖DMEM培养基(Corning，美国);胎牛血清(Gibco，美国);cocktail蛋白酶抑制剂(Roche，中国);TEMED、BSA、DMSO(Sigma，美国)。
1.2方法
1.2.1牙髓细胞的获取和原代培养无菌条件下劈冠获取牙髓细胞。在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。其后根据需要进行传代，并在使用第3～5代的牙髓细胞进行相关实验。
1.2.2大鼠牙髓炎模型的建立按照文献[8]方法建立大鼠牙髓炎动物模型：6周龄SD大鼠18只。根据体重行10%水合氯醛腹腔麻醉，涡轮机右侧下颌第一磨牙行开髓，暴露髓腔;并以自身未开髓牙做自身对照。分别在术后1、3和5d，脱颈处死并收集大鼠下颌骨，4%多聚甲醛固定，其后10%EDTA脱钙液脱钙。完全脱钙后脱水、浸蜡、石蜡包埋。
1.2.3石蜡切片苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化组织切片;苏木精染色3min，流水冲洗，盐酸乙醇分色，氨水返蓝;0.5%伊红液染色5min，蒸馏水冲洗;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.4免疫组织化学染色二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化组织切片;抗原修复液95℃水浴恒温修复40min;按照R&D免疫组化试剂盒说明依次进行抗原封闭;其后滴加一抗工作液[肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，1∶100;IL-17，1∶800]，4℃过夜;次日复温后，PBS摇床清洗;依次孵育二抗和HRP;DAB显色。苏木精复染，氨水返蓝，盐酸酒精分色;脱水、封片。
1.2.5RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR(re-altimequantitativePCR，RT-qPCR)牙髓细胞中的RNA提取采用TRIzloTM(Ambion，LifeTech-nologies，USA)萃取法按照厂家说明提取。随后，cDNA的逆转录使用RT逆转录试剂盒(TaKaRaBiotechnology，China)进行。最终使用SsoAd-vancedTMSYBR?GreenSupermix荧光染料进行RT-qPCR反应。引物序列如下：IL-17，F：5′-CTA-CAACCGATCCACCTCACC-3′;R：5′-AGC-CCACGGACACCAGTATC-3′。GAPDH，F：5′-TCAACAGCGACACCCACTC-3′;R：5′-GCTG-TAGCCAAATTCGTTGTC-3′。MMP-1，F：5’-TGGTGTTGCCTGCTGCCTTC-3’，R：5’-TCATCTGCACAGCTCTGGC-3’;MMP-2，F：5’-ATGCAGTGGGGGCTTAAGAA-3’;R：5’-TCT-GGGGCAGTCCAAAGAAC-3’。MMP-13，F：5’-GCACTTCCCACAGTGCCTAT-3’;R：5’-AGT-TCTTCCCTTGATGGCCG-3’。其中，以GAPDH作为内参。反应条件如下：95℃预变性10s1个循环，95℃5s和60℃30s40个循环。mRNA的相对浓度采用2-△△Ct法计算。
1.2.6蛋白提取、蛋白浓度测定及Westernblot收集细胞，使用蛋白裂解液(ThermoFisherScien-tific，Hudson，NH)按照说明进行裂解，提取蛋白。使用BCA检测试剂盒测定蛋白浓度(碧云天，中国)。将蛋白样品与蛋白上样缓冲液混合，水浴变性。点样进行电泳，至溴酚兰跑出玻板后终止电泳。恒流250mA，转膜60min。5%脱脂奶粉封闭1h;一抗(GAPDH1∶5000，信号通路各抗体浓度均为1∶1000)，4℃孵育过夜;洗膜，加入山羊抗兔二抗(1∶5000)，室温孵育1h，洗膜;加显影液显影，BIO-RAD化学发光成像系统中成像并分析结果。
1.2.7胶原酶谱和明胶酶谱检测MMP-1和MMP-2酶活性。体外培养人牙髓细胞，当融合度达到70%～80%时，实验组加入重组TNF-α蛋白(10ng/mL)，对照组加入等体积PBS，处理48h后收集培养基。高速离心，取上清与样本缓冲液混合。将混合的液体在10%的丙烯氨凝胶中进行电泳(明胶中含有1%明胶，胶原酶谱中含有1%鼠尾胶原)。电泳完成后将凝胶置于孵育缓冲液中，37℃孵育基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)与细胞外基质的降解和改建密切相关，并协48h，其后使用考马斯亮蓝染色。明胶酶谱用来检测MMP-2的活性，胶原酶谱用来检测MMP-1的活性。
1.2.8ELISA检测IL-17蛋白表达体外培养人牙髓细胞，加入重组TNF-α(10ng/mL)处理48h，并以空培养基培养48h作为空白对照，其后收集细胞培养基上清。ELISA法检测两组细胞IL-17表达。
2结果
2.1IL-17在牙髓炎症过程中的时空表达HE染色结果显示牙髓形态和炎症状况：正常牙髓组织被牙本质包绕，紧靠牙本质的成牙本质细胞层，内侧依次为乏细胞层，富细胞层和中央区，层次分明;而在炎症牙髓中，开髓孔下方的炎症区域有大量炎细胞浸润，并有扩张充血的血管。随着牙髓炎症的发展，牙髓组织破坏增多，炎症从冠髓发展到根髓(图1～图3)。
免疫组织化学染色结果发现，在炎症牙髓组织中，大量炎性细胞浸润的区域有TNF-α高表达，提示该处发生明显炎症，并且在同一区域IL-17的表达增强，而在正常牙髓中IL-17表达不显著(图1～图3)。牙髓炎症1、3和5d的标本免疫组织化学染色结果显示，IL-17在牙髓炎症的发展过程中持续于炎性细胞浸润局部高表达。上述结果提示，在牙髓炎过程中局部IL-17始终高表达，IL-17参与了牙髓炎的发生发展。
2.2体外模拟炎症介导牙髓细胞中IL-17表达体内实验结果提示IL-17在炎症牙髓中有高表达。为进一步探究IL-17在牙髓炎中的作用和功能，体外使用重组TNF-α蛋白刺激牙髓细胞，模拟牙髓炎症。RT-qPCR检测IL-17基因水平表达的变化，ELISA检测IL-17的蛋白表达改变。结果表明，IL-17mR-NA表达水平在TNF-α刺激后1h(3444.00±37.50)显著高于对照组(1.01±0.04)，P<0.001。蛋白表达水平在TNF-α处理后24h[(31.85±3.65)pg/mL]相较于对照组[(5.74±1.60)pg/mL，P<0.05]也明显上调。结果说明，TNF-α模拟炎症刺激可以介导牙髓细胞产生IL-17，牙髓细胞可通过产生IL-17参与了牙髓免疫的过程。
2.3IL-17对牙髓细胞中MMP-1和MMP-2表达的影响文献表明IL-17可以刺激多种炎性因子和趋化因子的表达，具有促炎作用[3]。MMP是牙髓炎症中促使牙髓组织水解破坏的重要因子，目前对IL-17在牙髓炎症中与MMPs的联系尚缺乏研究。为了进一步探究IL-17在牙髓炎症过程中的作用，体外使用人重组IL-17蛋白(10ng/mL)刺激人牙髓细胞4h，通过RT-qPCR检测的MMP-1和MMP-2的基因表达水平变化。MMP-1的表达在IL-17蛋白刺激的牙髓细胞中(4.48±0.69)较对照组细胞(1.01±0.03，P<0.001)，有显著提高，同样，IL-17刺激下MMP-2的基因表达水平(1.57±0.29)相比对照组(1.00±0.02，P<0.001)，也有上调。明胶酶谱和胶原酶谱分别检测IL-17刺激人牙髓细胞后MMP-1和MMP-2在酶活性改变情况，结果表明牙髓细胞在受到IL-17刺激后MMP-1和MMP-2的酶活性显著上调(图4)。这说明牙髓炎症反应中，IL-17可以刺激牙髓细胞MMP-1和MMP-2酶活性增强，MMP-1和MMP-2酶活性升高可进一步导致炎症中细胞外基质的降解。
2.4IL-17可通过激活丝裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路介导牙髓炎症NF-κB以及MAPK通路是炎症过程中的重要细胞通路，为了进一步了解IL-17对牙髓炎症的调控机制，检测了正常牙髓细胞以及IL-17刺激下牙髓细胞中的NF-κB以及MAPK信号通路的活化状况。结果显示IL-17刺激牙髓细胞后，MAPK(p38)通路在30min时被活化，磷酸化水平上调(图5)。这表明IL-17对牙髓炎症反应的调节作用可通过MAPK(p38)通路实现。
3讨论
IL-17高表达于多种炎性疾病和自身免疫性疾病[3，4，10]，发挥促炎症破坏和抗感染的双重作用。随着研究深入，近期对其在口腔相关疾病中的作用也得到了揭示。多篇文献提示IL-17在根尖周炎和牙周炎中高表达，并且介导了炎症的发生和骨的破坏[11，12]。2014年的一项研究报道IL-17在炎症牙髓中呈明显高表达[13]，并能够引起牙髓细胞产生IL-6和IL-8两种重要的炎性因子，但是在这项研究中缺少体内实验和蛋白表达的结果支持。在本实验中，通过构建的大鼠牙髓炎模型并进行免疫组织化学染色，发现IL-17在炎症牙髓中表达明显上调，这从体内和蛋白表达水平上印证了之前对于IL-17在牙髓炎中相关研究结果。并且通过多个时间点的检测，发现IL-17在牙髓炎症发展过程中持续高表达，说明IL-17在牙髓炎进程中持续发挥作用。
IL-17不仅可以由Th17细胞、巨噬细胞，肥大细胞等多种免疫细胞产生，而且可以由部分非免疫细胞产生[14-16]。牙髓细胞作为一种成纤维细胞，是牙髓的主要构成细胞。本研究使用经典炎性细胞因子TNF-α[17]刺激人牙髓细胞模拟炎症反应，在基因水平和蛋白水平上均能导致IL-17表达升高。牙髓细胞作为一种非免疫细胞，在牙髓炎症中可通过产生IL-17达到促炎或抗感染的作用，从而参与牙髓免疫的过程。
Ⅰ型和Ⅲ型胶原是牙髓组织中最为主要的胶原成分，并且其中Ⅰ型胶原被认为与牙髓损伤修复密切相关[18]。在本研究中，IL-17的刺激可以导致牙髓细胞MMP-1和MMP-2基因表达和酶活性上调。MMP-1活性上调可能会导致牙髓Ⅰ型胶原降解增多，而MMP-2活性上调会导致牙髓中变性胶原的明胶的降解增多[19]。因此，IL-17通过介导MMP-1和MMP-2的酶活性增强，发挥促进炎症和牙髓坏死崩解的作用。MAPK通路是促炎细胞间信号级联的重要通路[20]，并参与调控包括细胞功能、基因表达、分化、凋亡等多种生物学过程。在本研究中发现IL-17刺激牙髓细胞可以激活MAPK通路。这提示IL-17的促炎作用可能是通过MAPK通路实现的。
综上所述，在本实验中发现在牙髓炎症过程中IL-17表达升高，高表达的IL-17可以通过介导MMP-1和MMP-2的酶活性上调发挥促炎作用。——论文作者：刘梦余
