摘要维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)是一种革兰氏阴性致病菌，引发水产动物以及人类的多种疾病，对水产养殖业以及人类公共健康造成严重威胁，但其致病机制尚不明确。维氏气单胞菌C4菌株基因组分析发现，与细菌Ⅲ型分泌系统有关的鞭毛合成基因fliE相邻位置存在一个功能未知的AraC家族转录因子编码基因，我们将其命名为asfR。NCBICD-Search预测结果显示AsfR蛋白含有一个保守的HTHDNA结合功能域，以及一个类似GyrI的小分子结合功能域。已知AraC蛋白超家族广泛存在于细菌中，参与从碳代谢、应激反应，到细菌毒力和致病性的多种生命活动的调节。asfR基因在维氏气单胞菌AVNIH1和TH0426菌株中高度保守，但对其生物学功能的研究尚未见报道。为进一步探究该蛋白的功能，本研究采用同源重组手段构建asfR基因敲除菌株，并与野生型菌株进行初步比较，发现asfR基因敲除不影响致病菌在富营养条件下的生长能力，但能显著提高其在逆境下的生长能力，而且其生物膜形成能力减弱。上述结果表明，AsfR参与维氏气单胞菌生物膜形成以及逆境抵抗。本研究为进一步鉴定该蛋白的生物学功能提供了必要的研究工具和初步的理论基础。
关键词维氏气单胞菌,asfR,基因敲除,生长,生物膜
维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)是一类造成严重危害的革兰氏阴性致病菌，引起鱼体烂尾病、败血症等(Malliketal.,2020;Ranetal.,2018)，还能引发人类腹泻、脑膜炎、坏死性筋膜炎等疾病(Predigeretal.,2020;Parrasetal.,1993;Cuietal.,2007)。维氏气单胞菌能分泌多种与其致病性密切相关的胞外产物，包括气溶素、溶血素、肠毒素、蛋白酶等(Huetal.,2012;Ranetal.,2018)。已知细菌Ⅲ型分泌系统T3SS是革兰氏阴性致病菌的关键毒力因子，其发挥分子注射器的功能，将大量效应物注射到宿主细胞的胞浆中，进而影响宿主的细胞代谢通路(GalánandWolf-Watz,2006)。新近研究表明，细菌的鞭毛活性，通过影响其在感染部位的运动能力，进而间接调控Ⅲ型分泌系统功能(Hirakawaetal.,2020)。另外，在面临宿主以及自然环境中的恶劣条件时，致病菌通常以形成生物膜的方式提高种群生存率,包裹在生物膜内的细菌细胞对宿主体内的免疫细胞、抗体和抗生素等具有抵抗力，使得宿主防御系统和抗菌药物无法清除生物膜内的细菌病原体(Royetal.,2018,Diasetal.,2018)。深入探究A.veronii的致病机制，将为预防与治疗该致病菌导致的动物和人类疾病、减轻其所造成的经济损失提供理论依据。
我们前期对维氏气单胞菌C4的基因组数据进行分析发现，在与Ⅲ型分泌系统有关的鞭毛合成基因fliE的相邻位置处，存在一个功能未知的基因，其被注释为AraC超家族转录调控因子(AraCfamilytranscriptionalregulator)编码基因，我们将其命名为asfR(AraCSuperfamilyregulator)。通过NCBI比对发现，该基因在维氏气单胞菌的强毒株系AVNIH1和TH0426中高度保守，同源性达98%。NCBICD-Search预测结果显示，AsfR蛋白含有一个保守的AraC家族HTHDNA结合功能域，以及一个类似GyrI的小分子结合功能域。已知AraC转录因子蛋白超家族广泛参与革兰氏阳性和阴性细菌的碳代谢、应激反应、毒力以及耐药性等多种生命进程(Yangetal.,2011;Pletzeretal.,2014;Santiagoetal.,2016;Gallegosetal.,1997)。在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，一个假定AraC家族转录因子基因邻近胆固醇降解相关的芳胺N-乙酰基转移酶(nat)基因，其被鉴定能激活nat基因簇(Evangelopoulosetal.,2014)。为了探明AsfR的生物学功能，本研究采用同源重组基因敲除技术，构建了asfR基因敲除菌株，并与维氏气单胞菌野生型进行比较，初步测定敲除株的生长能力和生物膜形成能力。本研究的结果为进一步研究AsfR蛋白在维氏气单胞菌致病性调控方面的功能提供了必要的研究工具，并奠定了初步的研究基础。
1结果与分析
1.1基因敲除载体的构建
以A.veroniiC4的基因组为模板，设计特异性引物(表1)分别扩增asfR基因上下游同源臂，基于同源重组原理对A.veroniiC4asfR基因进行敲除(图1)。扩增结果如图2所示，参照DNAMarker条带大小，asfR上/下游同源臂片段分别为500bp和750bp左右，与实际asfR上/下游同源臂片段大小536bp和705bp相符。采用重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR)连接asfR上下游同源臂，获得融合产物1300bp左右(图2)。PCR产物条带单一、无污染，符合后续实验要求。
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采用无缝克隆技术连接asfR同源臂和pRE112质粒(图3)。将pRE112质粒酶切后，与asfR同源臂按摩尔比1:2的体系混合，在重组酶的作用下于50℃连接5分钟。将连接产物以电击转化的方式导入至E.coliWM3064中，并涂布于含有50μg/mLDAP(二氨基庚二酸)和25μg/mLCam(氯霉素)的LB板上进行筛选，其中，DAP为E.coliWM3064的必需营养物质，Cam用于筛选阳性转化子。随后，通过pRE112载体特异性引物以及目的基因验证引物(表1)验证阳性转化子。图4显示通过pRE112载体特异性引物验证的结果，泳道2阳性对照的模板为pRE112质粒，扩增条带大小约600bp;泳道5、7、8、9以转化子菌液为模板，获得PCR产物为1900bp左右，与理论值相符。泳道3的转化子产物大小有偏差，泳道6的转化子产生两条产物带，因而将其舍弃。图5显示进一步通过目的基因验证引物验证的结果，泳道2的阳性对照为以A.veroniiC4基因组为模板进行扩增的PCR产物，条带大小为2000bp左右;泳道5、7、8、9以转化子菌液为模板，获得PCR产物为1500bp左右，与理论值相符。将检测的阳性转化子进行测序，测序结果比对分析进一步证实asfR基因敲除载体pRE112-ΔasfR构建成功。
1.2细菌接合
通过细菌接合的方式将E.coliW3064菌中的asfR敲除载体pRE112-ΔasfR转移至维氏气单胞菌C4中，通过25μg/mLCam和50μg/mLAmp的双抗平板筛选获得敲除载体的受体克隆子。采用pRE112载体特异引物，通过菌落PCR验证阳性克隆子。验证结果如图6所示，泳道2-9中的PCR产物条带大约为1900bp左右，与理论结果相符，表明pRE112-ΔasfR载体已经成功转移至A.veroniiC4中(图6)。
1.3蔗糖板筛选asfR基因敲除菌株
挑取平板单菌落，将含有pRE112-ΔasfR载体的维氏气单胞菌C4于LB中过夜培养后，然后涂布于含有8%蔗糖的平板上进行筛选，菌落PCR验证阳性克隆子。以A.veroniiC4野生型基因组为模板所扩增的PCR产物为阳性对照。验证结果如图7所示，结果表明ΔasfR敲除株中扩增的条带大小约1500bp(泳道4-16)，而野生型阳性对照中扩增的条带大小约2000bp(泳道1)，表明重组菌株中目的基因asfR敲除成功。将PCR产物测序，结果显示ΔasfR的测序结果与WT中asfR基因编码区域存在序列不一致的情况，而与asfR基因上下游同源臂序列完全一致，结果进一步证实维氏气单胞菌C4asfR基因敲除菌株ΔasfR已构建成功(图8)。
1.4asfR敲除对维氏气单胞菌生长的影响
为了分析asfR基因敲除后对菌株生长的影响，我们分别在富营养(LB培养基)和寡营养(M9培养基)条件下比较维氏气单胞菌C4野生型(WT)和ΔasfR的生长情况。结果显示，在富营养条件下，WT和ΔasfR的生长能力无明显差异(图9);但在寡营养条件下培养大约5h时，ΔasfR菌株的生长速度开始超过WT菌株，在培养至大约35h时，两者的生长差异达到最大(图10)。该研究结果表明，asfR基因敲除能够增强维氏气单胞菌在营养匮乏的逆境条件下的生长能力。
1.5asfR基因敲除对生物膜形成的影响
采用结晶紫染色方法，探究asfR基因敲除对菌株生物膜形成的影响。将WT和ΔasfR菌株分别定量培养于96微孔板中，培养36h后，将96孔板中的培养液分别吸出，用无菌PBS冲洗，随后经0.5%结晶紫染色、无菌水冲洗、33%醋酸溶解等步骤后，测量吸光度值。结果显示，与WT相比，ΔasfR的生物膜形成能力显著较弱，二者之间具有极显著性差异(P<0.01)(图11)。结果表明AsfR对A.veroniiC4的生物膜形成能力具有促进作用。
2讨论
本研究基于同源重组原理，通过自杀质粒与C4基因组两次同源重组，对目的基因asfR进行敲除。基于同源重组原理进行的基因敲除，是目前研究生物体内基因功能的一种重要且广泛使用的方法，操作对象不限于细菌(Swingleetal.,2010)，古菌(王小利等，2015)，还包括真菌(SymingtonandGautier,2011)，植物(Reiss,2003)，动物(Lanetal.,2016)等真核生物。同源重组技术通常将目的基因的上、下游同源臂分别通过PCR扩增获得，经限制性内切酶酶解，然后由DNA连接酶连接至自杀质粒中(Celieetal.,2016)。该种方法需要保证DNA片段和质粒同时具有所适用的限制性内切酶酶切位点，而且有时需要进行分步酶切，这增加了实验操作的复杂度，并会损耗实验样品量(Shaoetal.,2009)。本研究在连接自杀质粒之前，采用重叠延伸PCR技术连接asfR上/下同源臂，有利于降低多片段与载体连接的难度，并提高重组载体构建成功率(Raymondetal.,1999;DahmandJennewein,2010)。随后，本研究采用无缝克隆技术连接片段和载体。无缝克隆技术无需对目的基因片段进行酶切，消除了限制性内切酶的限制，简化了操作步骤(Birdetal.,2014)。
生物膜是与致病菌毒力相关的另一重要因素，生物膜的形成使得致病菌能够耐受恶劣的生存环境，并对抗菌治疗以及宿主的免疫系统产生抵抗力，从而导致多种慢性疾病(Royetal.,2018)。群体感应特性、胞外多糖(EPS)，以及由细菌鞭毛介导的游泳和群集运动等都是决定生物膜形成的重要原因(Packiavathyetal.,2014)。本研究发现，asfR基因敲除株与维氏气单胞菌野生型相比，其在富营养条件下的生长能力没有差别，但逆境环境下的生长能力提高，而且其生物膜形成能力减弱。在维氏气单胞菌胞外分泌产物的调控研究中报道了类似的现象，编码胞外分泌产物组分的hisJ基因被敲除后，敲除株与野生型相比在富营养条件下的生长能力无显著差异，但生物膜形成能力下降，并且毒力也下降达865倍(Zhangetal.,2020)。由于asfR基因与Ⅲ型分泌系统相关的鞭毛合成基因fliE相邻，我们预测AsfR可能通过转录调控鞭毛合成基因fliE，进而对三型分泌系统，以及细菌毒力产生影响。本研究初步鉴定了未知蛋白AsfR的生物学功能，为研究维氏气单胞菌的致病机制提供了一定的理论基础。
3材料与方法
3.1实验材料
自杀型质粒pRE112、E.coliWM3064均为实验室所储存;实验所涉及引物以及样品测序由上海生工提供服务。本研究涉及的引物如表1所示。实验所用试剂盒以及其他实验试剂如表2所示。
3.2asfR基因上下游同源臂片段的扩增
以维氏气单胞菌基因组为模板，采用引物对asfRF1/R1扩增目的基因asfR的上游同源臂片段，引物对asfRF2/R2扩增下游同源臂片段。PCR加样体系(50μL)为：基因组DNA2μL(30ng/μL)，2×PCRMix25μL，上/下游引物各2μL，ddH2O19μL。PCR扩增程序为:95℃10min，95℃30S，56℃30S，72℃1min30S，30cycles，72℃10min。使用PCR产物纯化试剂盒将PCR扩增获得的asfR基因上下游同源臂片段进行纯化回收，于-20℃保存。
3.3重叠延伸PCR技术连接asfR基因上下游同源臂片段
以asfR基因上下游同源臂的重叠部分互补配对，进行退火，延伸15个循环。PCR加样体系(50μL)为：asfR基因上/下游同源臂DNA各2μL，2×PCRMix25μL，ddH2O21μL。PCR扩增程序为:95℃10min，95℃30S，56℃30S，72℃1min30S，15cycles，72℃10min。在上述反应体系中加入引物对asfRF1/R2各1μL，继续20个循环的PCR扩增，使用PCR产物纯化试剂盒进行回收及纯化。
3.4pRE112-ΔasfR载体构建
使用KpnI和SacI酶切pRE112质粒。将酶切后的质粒与融合的asfR同源臂按下列连接反应体系(10μL)混合：4μLpRE112酶切产物(31ng/μL)，1μLasfR同源臂酶切产物(50ng/μL)，5μL2×ClonExpressMix。将连接产物于50℃连接5min，电击转化至E.coliWM3064感受态细胞中。将电转后的感受态细胞涂布于含有25μg/mLCam的抗性平板上，在37℃下倒置培养。菌落PCR验证阳性克隆子。
3.5细菌接合
将维氏气单胞菌C4和携带pRE112-ΔasfR载体的E.coliWM3064分别于含25μg/mLCam和50μg/mLAmp的LB培养基中过夜培养。按0.02OD/mL转接，并培养至OD值为0.4-0.6，将维氏气单胞菌C4和E.coliWM3064按1:1，2:1，1:2的比例混合至终体积为800μL。6000rpm离心3min后弃上清，重悬菌体。取50μL滴于含有50μg/mLDAP的LB培养平板上，30℃倒置培养24h。刮取平板上的菌落，涂布于含有25μg/mLCam和50μg/mLAmp的双抗平板上，菌落PCR验证接合子。
3.6蔗糖板筛选
挑取成功接合的单菌落，接种到LB培养基中，30℃过夜摇菌。取100μL菌液，涂布于8%蔗糖板上。于30℃下倒置培养24h。菌落PCR验证asfR敲除菌株，随后送往上海生工测序。——论文作者：常慧敏马香*李宏唐燕琼王丹唐鸿倩刘柱
