摘要：从多种来源样品中分离筛选高产蛋白酶的菌株，为微生物发酵玉米蛋白粉产玉米肽，即玉米蛋白粉的增值及综合利用提供菌株资源。采用固体筛培法和福林酚法等方法筛选降解玉米蛋白粉的菌株，并在形态及16SrDNA序列分析多样性的基础上，鉴定菌株，进行目标菌株蛋白酶活性和生长特性的研究。结果显示：获得分离菌株405株，其中具有蛋白分解能力的目标菌株58株，归属于4科，5属，17种，2个亚种，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、游动微菌属(Planomicrobium)等，并以芽孢杆菌属(Bacillus)丰度最高。目标菌株均能分泌碱性、酸性和中性蛋白酶，菌株碱性蛋白酶活性普遍较高。对8株代表性目标菌株进行了生长特性研究，生长最适温度一般在30~40℃、最适pH一般在7~9。研究还发现蛋白酶活性及生长特性具有菌株特异性。
关键词：玉米蛋白粉;蛋白酶活性;玉米肽;菌株筛选方法;芽孢杆菌属
玉米是全世界的主要粮食作物之一，我国播种面积3亿亩左右，年产量两亿多吨[1-2]。玉米蛋白粉是玉米淀粉加工生产过程的主要副产物，产量巨大。但由于玉米蛋白粉的水溶性差及直接利用的生物学价值低等原因，严重限制了其在食品工业中的应用，大多仅被当作饲料或废弃物[1-2]。因此开发玉米蛋白粉高效加工利用技术具有重要应用价值。玉米肽是玉米蛋白的水解产物，其具有易消化吸收、抗氧化等优良特性[3-5]。目前利用玉米蛋白制备玉米肽的方法主要包括化学法、酶解法和微生物发酵法[2-3]，微生物发酵法产玉米肽，较之其他产肽方法(酶法和化学法)，能修饰重组苦味基团，减少苦味，同时使玉米肽的抗氧化性、解酒、抗疲劳、降血压、抗炎、抗癌、抗糖尿病等功能得到更充分的发挥和应用[2,5-7]，是一项具有广阔应用发展前景的玉米蛋白粉加工技术。我国在生物活性肽尤其在玉米肽研究上起步晚于欧美，但是近些年越来越受到关注和重视[2,5-6]。但微生物发酵玉米蛋白粉产功能肽的研究相比酶法等还处于早期研究阶段[2,6,8]，面临适宜发酵微生物资源及其蛋白酶认识和开发不足、微生物种类较单一以及相应发酵工艺建立等亟待解决的问题。其中，筛选获得降解玉米蛋白粉能力强和具高效蛋白酶活性的菌株成为微生物发酵生产应用的基础和关键所在。
鉴于此，本研究从多种来源样品中，利用玉米蛋白粉固体筛培法和福林酚法等技术，分离筛选高蛋白酶活性的菌株;进行菌株鉴定及生长特性的研究，评价这些菌株的蛋白分解能力和可利用性能，为解决和提高微生物发酵玉米蛋白粉的高效微生物资源缺乏及发展应用技术奠定了基础。
1材料方法
1.1材料
玉米蛋白粉及分离所用传统发酵食品(酸奶、益生菌饮料、发酵面团等)：市购;菌株基因组提取试剂盒(TIANampBacteriaDNAKit)：北京天根生化科技有限公司;酪蛋白、福林酚：北京索莱宝科技有限公司;配制培养基的各种样品、试剂，均为国产分析纯：国药集团。
测定蛋白酶活的试剂：无水碳酸钠溶液、三氯乙酸溶液、磷酸缓冲液(pH分别为4.5、7.2、9.3)。
菌株分离纯化采用LB培养基：酵母提取物5.0g、胰蛋白胨10.0g、NaCl10.0g、琼脂粉20.0g、蒸馏水1.0L、pH7.0~7.5。
菌株筛选采用玉米蛋白粉培养基：玉米蛋白粉30g、KH2PO43.0g、K2HPO42.0g、NH4Cl0.1g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl5.0g、蛋白胨1.5g、牛肉膏0.6g、琼脂20.0g、蒸馏水1.0L、pH7.0~7.5。
玉米蛋白粉粉碎过100目筛。以上培养基调节pH值后，灭菌条件为121℃，20min。
1.2实验仪器
pH计，FE20K：瑞士梅特勒–托利多(METTLERTOLEDO)公司;超净工作台，DL-CJ-1N：河南兄弟仪器设备有限公司;振荡培养箱，SHK-99-II：北京北方同正生物技术发展有限公司;微型旋涡仪，V2S02S：德国艾卡(IKA)公司;恒温水浴锅，SM-8D：南京舜玛仪器设备有限公司;酶标仪，SynergvHT，美国伯腾(BIOTEK)公司;台式高速冷冻离心机，EPPENDORF5810R，德国艾本德(EPPENDORF)公司;PCR仪，C1000Touch：美国伯乐(BIORAD)。
1.3实验方法
1.3.1菌株分离纯化
分离采用传统平板涂布法。将样品悬液适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的LB琼脂平板上，然后用无菌刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，30℃恒温培养，观察挑取单个菌落。
纯化采用平板划线法。利用无菌接种环取菌株培养物少许在平板上进行划线。经培养后，划线上的单个细胞形成纯的单菌落。
1.3.2菌株初筛
菌株纯化菌液10~20μL接种到玉米蛋白粉平板筛选培养基的无菌滤纸片上或空孔中(直径均为0.5cm)，放入30℃恒温培养箱中培养72h，每隔12h观察测定菌落周围透明圈的大小。
1.3.3菌株蛋白酶活性测定复筛初筛
后出现水解透明圈的菌株进行复筛。接种待测菌株于LB液体培养基中，在37℃，150r/min条件下振荡培养后，接种于玉米蛋白粉基础发酵液培养基中，在37℃，150r/min条件下发酵培养48h后，离心(4000r/min，10min)，取上清液为待测样品，测定蛋白酶活性。按照福林酚试剂法测定发酵液中上清液的蛋白酶活性(GB/T28715—2012饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定，SB/T10317—1999蛋白酶活力测定法)。
1.3.4序列分析和菌种鉴定
将分离纯化后的细菌菌株接种到LB液体培养基中，在37℃，170r/min的条件下振荡培养48h，再利用细菌基因组试剂盒提取基因组DNA。采取试剂盒抽提得到细菌DNA后，通过PCR扩增16SrDNA，配置50μL的反应体系，细菌16SrDNA引物为27F和1492R。PCR循环程序为：95℃预变性5min，95℃30s，52℃30s，72℃90s，30个循环;72℃延伸10min。扩增得到的细菌PCR产物送至上海生工生物科技有限公司测序，测序的长度在1400bp左右。采用DNAMAN软件序列图谱对测序结果进行人工校对拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16SrDNA序列区序列，Bioedit比对后用MEGAX软件采取ML法构建系统发育树，可靠性检验bootstrap法，初始值1000次。系统发育树中本研究测得的序列号为MW090728-MW090784，Genbank中下载用于比对分析做系统发育树的序列有MH997645、MK993455、KY129662、MN227492、MT539148、MT039450、MK629812、MN209912、MN733170、NR_104873、KM234223、FJ613555、MN865799、MK990073、MT457707、NR_042254、MH734924、MN204064。1.3.5菌株生长特性研究生长曲线。采用LB培养基，30℃测定菌株生长曲线。YTSS培养基，每隔4h取样一次测OD600值。
生长温度。配置LB培养基，2%接种量，在温度梯度4~70℃培养，测定菌株生长的温度范围及最适生长温度。
生长pH。配置LB培养基，2%接种量，调配培养基pH2~12，测定菌株生长的pH范围及最适生长pH。
2结果与讨论
2.1样品菌株分离纯化、菌株初筛及菌种鉴定
从各种传统发酵食品(酸奶、益生菌饮料、发酵面团等样品中共分离菌株405株，其中通过玉米蛋白粉平板筛选培养基初筛出现透明水解圈菌株58株，透明水解圈一般经过48h培养后根据不同菌株情况陆续出现，部分菌株透明水解圈图片见图1，菌株透明圈(H/C)值最大可达4.2，多数在1.5~2.5之间。提取能够产生透明水解圈菌株的基因组DNA，PCR扩增16srDNA序列，并测序获得高质量序列信息，通过NCBIBLAST比对确定菌株分类地位。结果显示筛选获得的细菌归属于4科，5属，17种，2个亚种。丰度最高为芽孢杆菌属Bacillus，具体见分类表1。菌株之间的系统发育进化树见图2。
目前，常见的产蛋白酶微生物包括枯草芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等[1,7,9]。微生物发酵菌种的选择标准一般有菌种繁殖速度快而稳定、分泌酶能力强、耐受性强等[1,2,5,7]。本研究中分离菌株数目最多的为芽孢杆菌。芽孢杆菌既可以产生中性蛋白酶，又可以产碱性蛋白酶[1]，并且被收录在我国食品目录上，是比较安全可靠的菌种。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，是常见的一种芽孢杆菌，分布广泛，能够帮助动物免疫器官发育，提升抗体和免疫球蛋白的水平，增强免疫力，还能够合成多种维生素类，并能合成脂肪酶、纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等酶类[1,5,7,10]。
研究中还发现了地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，该菌亦属于芽孢杆菌属。应用价值广泛，能够净化水质、降解毒害物质，调整肠道菌群及肠道功能，也能够提高生物体免疫力，拮抗病原菌等，并具有较强的蛋白酶、脂肪酶、纤维酶活性[11-12]。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)在农业上有促进植物生长和抵御病原微生物作用，具有广谱抗菌活性，并且用于开发生物药剂潜力巨大[13]。乳酸菌广泛用于乳制品、肉制品、水产品和果蔬产品等发酵，还可产生抑菌活性的代谢产物，作为生物保护菌[14]，本研究也有分离到。
相关期刊推荐：《粮油食品科技》1991年创刊，主要读者：粮油食品加工企业、粮库、粮油检测机构、大专院校和科研设计院所等。设有：粮食加工、油脂加工、营养与品质、质量安全、仓储物流、粮油食品、生物工程、科技与产业等栏目。
值得注意的是中华游动微菌(Planomicrobiumchinense)最早分离自我国海岸沉积物[15]，本研究分离自发酵海产品，而建立该属的模式种韩国游动微菌(Planomicrobiumkoreense)，也是分离自韩国传统发酵海产品[16]，也有该属种分离自章鱼肠道并报道具有蛋白酶活性[17]。
2.2菌株蛋白酶活性测定复筛
筛选得到的58株菌株的碱性、中性、酸性蛋白酶活性测定结果见表2。从研究结果可看出筛选获得的菌株中性蛋白酶活性和碱性蛋白酶活性普遍高于酸性蛋白酶活性，并且碱性蛋白酶活性普遍较高，一般大于60U/mL，大于90U/mL的有8株，分离到的芽孢杆菌、乳酸菌、游动微菌等都表现出较高的蛋白酶活性，显示出巨大的碱性蛋白酶资源潜力。
2.3菌株生长特性研究
通过前面的菌株分离纯化、初筛和蛋白酶活测定复筛，综合透明圈大小、酶活高低、菌株种类等因素，选出8株菌株进行了生长特性研究。8株菌的生长曲线见图3，生长温度曲线见图4，生长pH曲线见图5。生长曲线中(图3)，菌株的生长可分为两大类，一类菌株CGM54、CGM40、CGM47、CGM48、CGM8在生长48h左右达到峰值，另一类菌株CGM58、CGM56、CGM34在生长80h左右达到峰值。生长最适温度一般在30~40℃(图4)。生长最适pH一般在7~9(图5)。
本研究中生长特性也表现出菌株特异性，不同菌株间存在显著差异。细菌的生长繁殖一般包括四个阶段，迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。大部分筛选菌株在接种后几个小时内可进入快速的指数生长期，少数菌株则有缓慢适应生长阶段后，再进入指数生长期;培养菌株的指数生长期的持续时间也存在不同。例如CGM34和CGM40，16SrDNA序列比对都鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，但其生长曲线存在较大差异。生长温度、生长最适温度、生长pH及生长最适pH等和已报道的同类别菌株基本一致[1,13,15,16]，如中华游动微菌(Planomicrobiumchinense)被报道在10~45℃生长，最适生长温度为30~35℃，生长pH5~10，生长最适pH6~7[15]。菌株的生长特性研究十分重要，生长特性条件将为后续微生物发酵工艺的优化和生产利用等提供参考和基础。
3结论
筛选高效降解玉米蛋白粉的微生物菌株，是目前的重要研究领域。本研究分离筛选了高产蛋白酶菌株，从各种样品中共分离菌株405株，其中通过玉米蛋白粉平板筛选培养基初筛出现透明水解圈菌株58株，确定了菌株的系统分类地位;并结合菌株分离纯化、初筛和蛋白酶活测定复筛，综合透明圈大小、酶活高低、菌株种类等因素，选出8株菌株进行了生长特性研究，菌株一般生长最适温度一般在30~40℃，生长最适pH一般在7~9。蛋白酶活及生长特性等具有菌株特异性。本研究扩展丰富了后续微生物发酵玉米蛋白粉得到玉米肽的微生物菌株资源及微生物蛋白酶源，增加了微生物种类。后续将利用筛选菌株进行玉米蛋白粉微生物发酵产玉米肽的研究和优化发酵工艺的探索，为玉米蛋白粉的增值和综合利用提供理论和技术基础。——论文作者：任菲，刘玉春，王超，郭超
