摘要:[目的]：研究肺癌患者不同形态的肺部微生物组学分析。[方法]：收集2019年该院19例住院肺癌患者行肺癌切除术的肺组织(分别为距癌变1cm处的组织及相对远离癌变部位的组织)，进一步分离标本、DNA提取及通过Illumina平台采用16SrDNA高通量测序的方法，检测肺癌患者肺组织的微生物组学特征;并使用Metastats两两比较和Lefse判别分析等统计方法比较不同组别的微生物多样性和差异性。[结果]：肺癌患者肺部微生物多样性分析结果显示，属水平主要包括苍白杆菌属(19.4%)、沉积物杆状菌属(11.3%)、不动杆菌属(6.6%)等;A1组(距离癌变1cm处的组织)和B1组(远离癌变部位的组织)在分类群(Top>20)中主要包括苍白杆菌属、沉积物杆状菌属、不动细菌属、贪铜菌属、拟无枝酸菌等，两组差异无统计学意义(P>0.05);A2组(小细胞癌肺组织)和B2组(非小细胞癌肺组织)物种多样性分析两组差异无统计学意义(P>0.05)，物种差异性分析显示，A2组中物种丰度相对较高的为叶杆菌属，而在B2组内丰度相对较高的物种分别为假单胞菌、嗜热油菌纲，绿弯菌门、绿弯菌目，绿弯菌科，弧菌目，假交替单胞菌科、假交替单胞菌属，绿线菌属。[结论]：肺癌患者肺组织不同部位的微生物多样性并无差异，小细胞癌和非小细胞癌微生物的多样性并无差异，但非小细胞癌肺部存在更多的优势菌落。
关键词：肺癌微生物种群测序技术
在我国，肺癌死亡人数顺位为恶性肿瘤的第1位[1]。给社会带来巨大的医疗、经济负担。随着测序技术的发展，研究证实在健康状态下肺部也存在丰富的细菌微生物群落[2]。而人体微生物生态是指在一定空间范围内，细菌、真菌、病毒形成的微生物群落以其宿主的组织和细胞及其代谢产物为环境而形成的统一生物系统[3-4]。并且，肺部微生态与呼吸系统疾病的研究为目前研究热点。然而目前研究方向主要集中与肺部细菌微生态与慢性气道疾病[5-7]，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘。关于肺部细菌微生态与肺癌的相关研究相对较少。本次研究通过Illumina平台采用16SrDNA高通量测序的方法，研究肺癌患者不同分型的肺部微生物组学，分析肺癌患者肺组织的微生物组学特征，初步探讨了肺部细菌微生态与肺癌相关性以及可能的机制。
1.资料与方法
1.1一般资料
选取2019年住院患者19例病理诊断为肺癌的行肺叶切除术或修补术患者。其中男14例，女5例。平均年龄(59±6.8)岁。知情同意后术中无菌操作取黄豆大小肺组织一块液氮速冻后放置-80℃冰箱储存。取的部位为局部组织(癌变组织周围，距病变1cm处)和周围组织(相对远离癌变组织)。按照不同部位分为距离病变1cm处的组织为A1组、远离癌变部位的组织为B1组;按照不同病理状态分为小细胞癌的肺组织为A2组、非小细胞癌肺组织为B2组。
纳入标准：(1)年龄在30-85岁，无手术禁忌症，经组织病理学诊断为小细胞癌和非小细胞癌的住院患者;(2)入院前1周无抗感染治疗;(3)临床病例信息资料完整。
排除标准：(1)年龄<30岁或>85岁;(2)合并阻塞性肺炎;(3)合并支气管哮喘、肺结核、COPD、HIV、糖尿病、特发性肺纤维化等可能影响微生物组特征的其他疾病;(4)曾有粉尘接触史等特殊接触史患者;(5)切取肺组织过程中未按照无菌操作或被污染的标本;(6)临床信息资料不完整。所有标本的采集都经过医院伦理委员会的批准。
1.2.实验方法：
1.2.1.DNA提取：
该项目肺组织DNA抽提步骤如下：
(1)取100mg左右肺组织样品加入2mL离心管中，加3粒钢珠，液氮震碎，在组织破碎仪上50Hz，30s;
(2)加入700μLSDS裂解液，加入20μL蛋白酶K，65℃水浴放置40min，期间颠倒混匀数次，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，12000r/min离心10min。
(3)小心取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)顛倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液，转移至新1.5mL离心管中;加入2/3体积的上清体积的异丙醇;3μL糖原(20mg/ml);1/10体积的3mol/L的醋酸钠;混匀，—20℃静置30min以上，12000r/min离心10min。
(4)弃上清液，75%乙醇(现配现用)洗1遍，12000r/min离心5~10min，室温静置5min，至乙醇挥发完全，按DNA沉淀的多少加入DNase-free水(50~100μL)溶解DNA，轻柔吹打混匀，室温静置2~5min，直至DNA完全溶解。
1.2.2.PCR扩增16SrDNA基因功能基因的不同区域
本实验选用长度约为250bp的细菌16SrRNA基因的高度可变的V4区用来测序。PCR扩增选用细菌16SrDNAV4区特异性引物520F(5’-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3’)，802R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)。
1.2.3.文库构建
利用TruSeqNanoDNALTLibraryPrepKit进行建库。
(1)进行的末端修复过程是利用试剂盒中的EndRepairMix2将DNA5’端突出的碱基切除，3’端缺失的碱基补齐，同时在5’端加上一个磷酸基团;(2)3’端加A，这一过程中，DNA的3’端会单独加上一个A碱基，以防止DNA片段的自连，同时保证DNA与3’端有一个突出T碱基的测序接头相连;(3)加有特异性标签的接头，此过程是为了让DNA最终杂交到FlowCell上;(4)通过PCR扩增已经加上接头的DNA片段，然后利用BECKMANAMPureXPbeads纯化PCR体系;(5)通过2%琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化。
1.2.4文库质检与测序
1.2.4.1文库质检与定量
取1μL文库，在AgilentBioanalyzer机器上用AgilentHighSensitivityDNAKit对文库做2100质检，合格的文库应该有单一的峰，无接头。利用Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit在PromegaQuantiFluor上对文库进行定量，合格的文库计算后浓度应在2nmol/L以上。
1.2.4.2测序
对合格的文库，在MiSeq机器上利用MiSeqReagentKitV3(600cycles)进行2×300bp的双端测序。首先将需要上机的文库(Index不可重复)梯度稀释到2nmol/L，然后按所需数据量比例混样。混好的文库经0.1mol/LNaOH变性成单链进行上机测序。所上文库量的多少可根据实际情况控制在15~18pmol/L。
1.3.统计学处理
采用SPSS24.0软件、Mothur软件、R软件进行统计学分析和绘图，计数资料以率表示，比较采用t检验;样本间分类学组成的差异性分析使用Metastats分析和LEfse分析方法。检验水准a=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1肺癌患者肺部微生物种群在各分类单元的相对丰度门水平主要为变形菌门(78%)、拟杆菌门(12.3%)、放线菌门(3.9%)、栖热菌门(1.2%)、厚壁菌门(1.4%)。属水平主要为苍白杆菌属(19.4%)、沉积物杆状菌属(11.3%)、不动杆菌属(6.6%)、贪铜菌属(3.5%)、土壤杆菌属(2.4%)、拟无枝菌酸菌(1.7%)、鞘氨醇单胞菌属(1.4%)、甲基杆菌属(1.2%)、嗜热杆菌(1.2%)、短波单胞菌属(1.1%)、叶杆菌属(0.8%)、噬几丁质杆菌属(0.2%)、链球菌(0.2%)、韦荣球菌(0.1%)，以及未能分类到属层面的物种，包括丛毛单胞菌科(18.6%)、变形菌门(4.8%)、茎杆菌科(4.1%)、伯克霍尔德氏菌科(1.4%)、柄杆菌科(1.0%)，见表1。
2.2A1组和B1组在属水平菌群分类学组成A1组和B1组微生物种群在属水平层面顺位在前20的(TOP>20)包括苍白杆菌属、沉积物杆状菌属、不动细菌属、贪铜菌属、拟无枝酸菌、土壤杆菌属、假平胞菌属、栖热菌属、甲基杆菌属、短波单胞菌属、氨基杆菌、叶杆菌属、戴尔福特菌、链球菌、短杆菌属、不粘柄菌属、假单胞菌、葡萄球菌属、克拉菌属、鞘脂菌属，其中两组之间微生物物种丰度有差异的为甲基杆菌(P=0.036)和红游动菌属(P=0.03)，其他微生物物种丰度差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
2.3小细胞癌和非小细胞癌在属水平菌群分类学组成A2组和B2组微生物种群在属水平层面顺位在前20的(TOP>20)包括苍白杆菌属、沉积物杆状菌属、不动细菌属、贪铜菌属、拟无枝酸菌、土壤杆菌属、假平胞菌属、栖热菌属、甲基杆菌属、短波单胞菌属、氨基杆菌、叶杆菌属、戴尔福特菌、链球菌、短杆菌属、不粘柄菌属、假单胞菌、葡萄球菌属、克拉菌属、鞘脂菌属，微生物物种丰度两组之间均差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
2.4属水平小细胞癌组和非小细胞癌组优势种群通过Lefse判别分析，找出A2组和B2组有特异的主要菌群。小细胞癌组中主要菌群为叶杆菌属、动球菌科、噬纤维菌目、纤维粘网菌。非小细胞癌中主要菌群为假单胞菌科、假单胞菌属、嗜热油菌、SHA_31、绿弯菌门、绿弯菌目、绿弯菌科、弧菌目，假交替单胞菌科、假交替单胞菌属、绿线菌属等。
3.讨论
肺癌疾病负担严重，目前研究肺癌患者肺部微生物种群特征提供了新的视角[8-9]。本次研究通过收集肺癌患者肺部组织并进行微生物多样性测序。测序结果显示，肺癌患者肺部微生物门水平主要为变形菌门(78%)、拟杆菌门(12.3%)、放线菌门(3.9%)、栖热菌门(1.2%)、厚壁菌门(1.4%)。属水平主要包括苍白杆菌属(19.4%)、未分类的丛毛单胞菌科(18.6%)、沉积物杆状菌属(11.3%)、不动杆菌属(6.6%)等，APOPA[4]等对肺活检组织的微生态构成进行研究，发现肺癌患者有相似的微生态构成，以拟杆菌门和变形菌门为主，包括无色菌属、不动杆菌属、放线菌属、伊丽莎白菌属、罗氏菌属和鞘氨醇杆菌属等;同时，库克菌属、假单胞菌属、链球菌属和葡萄球菌属等机会致病菌也在肺癌患者中广泛存在。同时比较了同一患者距离病变组织1cm处的组织和相对远离癌变部位的组织的微生物组成情况。两组菌群序列量顺位靠前的为苍白杆菌属、沉积物杆状菌属、不动细菌属、贪铜菌属、拟无枝酸菌等，并且两组差异无统计学意义(P>0.05)。
一项大型的病例对照研究提示反复使用青霉素类药物、头孢类药物、大环内酯类药物会增加肺癌患病风险，提示肺部菌群失衡可能与肺癌相关[10]。菌群失衡表示某些致病细菌丰度的失调，进而可能通过产生过多的毒性物质、介导炎症反应而促进肺癌发生发展[11]。本次研究中A2组和B2组物种多样性分析，物种分类组成排在前20的物种两组之间并无差别(P>0.05)，通过判别分析进行物种差异性分析，A2组丰度均值相对较高的物种为叶杆菌属、动球菌科、噬纤维菌目、纤维黏网菌、而在B2组内丰度均值相对较高的物种分别为假单胞菌、嗜热油菌纲、绿弯菌门(Chloroflexi)、绿弯菌目、绿弯菌科，弧菌目、假交替单胞菌科、假交替单胞菌属、绿线菌属。本研究中非小细胞癌组别中基本为鳞癌，而鳞癌的发病机理与肺部炎症的发生、气道阻塞的形成等相关[11-12]，从而可能使肺部存在更多的优势菌落，并相比另外一组，该组中存在假单胞菌、假交替单胞菌科、假交替单胞菌属等潜在的定值菌，而该类菌属是引起肺部囊性纤维化、COPD等结构性肺病变等疾病的主要机会致病菌[13-15]。因此，肺部细菌与宿主之间可能存在复杂的相互作用。肺部细菌既可能可以促进肺癌发生发展，而宿主因素例如吸烟状态、基因突变又可能反过来影响肺部细菌，交织成复杂的关系网络。——论文作者：杨冬华1李文军2张慧玲1绽丽1刘佳雯1张永栋1
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