【摘要】目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)MINCR靶向微小RNA(miR)-876-5p调控膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的分子机制。方法体外培养人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1与膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3，采用反转录与荧光定量聚合酶链反应法检测LncRNAMINCR和miR-876-5p的表达量;将si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p、si-MINCR+anti-miR-NC、si-MINCR+anti-miR-876-5p转染入T24细胞，分别记为si-NC组、si-MINCR组、miR-NC组、miR-876-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-876-5p组、si-MINCR+anti-miR-NC组、si-MINCR+anti-miR-876-5p组;采用噻唑蓝法检测细胞活力;采用Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因实验检测LncRNAMINCR与miR-876-5p的靶向关系;蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9、天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)蛋白表达量。结果与SV-HUC-1细胞比较，膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3中LncRNAMINCR的表达水平升高[(2.25±0.20)、(1.84±0.18)、(1.61±0.12)比(1.00±0.10)]，miR-876-5p的表达水平降低[(0.38±0.03)、(0.46±0.04)、(0.51±0.05)比(1.02±0.12)](均P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-876-5p组细胞活力降低，迁移及侵袭细胞数减少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实LncRNAMINCR能够靶向结合miR-876-5p。与si-MINCR+anti-miR-NC组比较，si-MINCR+anti-miR-876-5p组细胞活力升高，迁移及侵袭细胞数增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(均P<0.05)。结论抑制LncRNAMINCR表达可减弱膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并诱导细胞凋亡，其作用机制与靶向调控miR-876-5p的表达有关。
【关键词】膀胱癌;长链非编码RNAMINCR;微小RNA-876-5p;增殖;迁移;侵袭;凋亡
膀胱癌是临床常见的一种恶性肿瘤，现代治疗技术已逐步完善，但患者预后仍然很差。目前膀胱癌发病机制尚未完全阐明，已有研究表明长链非编码RNA(LncRNA)在膀胱癌发生过程中可发挥一定作用，LncRNABLACAT2、LncRNAGAS6-AS2促进膀胱癌的增殖和转移[1-2]，而LncRNAPVT1、LncRNALINC00641抑制膀胱癌的进展[3-4]。LncRNAMINCR在胆囊癌中表达水平升高，并可通过刺激EZH2表达而促进胆囊癌的进展[5]。但LncRNAMINCR在膀胱癌中的表达及其在膀胱癌发病机制中的作用尚未阐明。靶基因预测显示LncRNAMINCR与微小RNA(miR)-876-5p存在结合位点，miR-876-5p在胃癌个体中表达下调，LncRNAFBXL19-AS1通过调节miR-876-5p/高迁移率族蛋白B3轴促进胃癌的发展[6]。但LncRNAMINCR/miR-876-5p轴在膀胱癌中的作用机制尚未可知。本研究主要探讨LncRNAMINCR与miR-876-5p在膀胱癌细胞中的表达及其对细胞生物学行为的影响。
1材料与方法
1.1材料与试剂人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1与膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3购自美国ATCC细胞库;DMEM培养基与胎牛血清购自美国Gibco公司;Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;反转录与荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂购自北京天根生化科技有限公司;si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p购自广州锐博生物科技有限公司;噻唑蓝(MTT)试剂、凋亡检测试剂、Matrigel基质胶购自北京索莱宝科技有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司;兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9、天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleavedcaspase-3)抗体购自美国SantaCruz公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。
1.2方法
1.2.1实验分组SV-HUC-1、T24、RT4、UM-UC-3细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素与100μg/ml链霉素的DMEM培养液中，待细胞生长融合度达到80%时进行传代培养。T24细胞中LncRNAMINCR的表达水平相对较高，取对数生长期T24细胞(2.5×105个/ml)接种于96孔板(100μl/孔)，按照Lipofectamine2000转染试剂说明书分别将si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p、si-MINCR+anti-miR-NC、si-MINCR+anti-miR-876-5p转染入T24细胞，分别记为si-NC组、si-MINCR组、miR-NC组、miR-876-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-876-5p组、si-MINCR+anti-miR-NC组、si-MINCR+anti-miR-876-5p组。同时将正常培养的T24细胞记为NC组。pcDNA-NC、pcDNA-MINCR转染入T24细胞，分别记为pcDNA-NC组、pcDNAMINCR组。
相关期刊推荐：《临床医药文献》JournalofClinincalMedicalLiterature(旬刊)2014年创刊，围绕国家不同时期医药卫生工作的重点，结合临床实际和重大疾病防治工作需要，并抓住学术研究中的热点、难点和焦点问题，实施有前瞻性的编辑策划工作。设有：综述、论著、临床交流、医药管理、临床护理等栏目。
1.2.2qRT-PCR法检测细胞中LncRNAMINCR、miR-876-5p的表达水平采用Trizol法提取SV-HUC-1、T24、RT4、UM-UC-3细胞及转染后各组T24细胞总RNA并检测RNA浓度，将RNA逆转录合成cDNA，cDNA稀释20倍后进行qRT-PCR，反应体系:cDNA2μl，Real-TimeMasterMix10μl，正反向引物各1μl，RNase-Free双蒸水补足体系至20μl;反应条件:95℃2min，95℃30s，58℃30s，72℃30s(循环30次)。LncRNAMINCR以β肌动蛋白为内参，miR-876-5p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算LncRNAMINCR、miR-876-5p的表达水平。
1.2.3MTT法检测细胞增殖活力取各组T24细胞(2.5×105个/ml)接种于96孔板(100μl/孔)后继续培养24h，每孔加入MTT溶液20μl后室温孵育4h，3000r/min离心5min(离心半径10cm)后弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜后室温孵育5min，检测各孔吸光度值。
1.2.4Transwell实验检测细胞迁移与侵袭取各组T24细胞(2.5×105个/ml)接种于小室的上室(200μl/孔)，下室加入含10%胎牛血清的培养液(600μl/孔)，将Transwell小室置于培养箱内孵育24h，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入多聚甲醛处理20min，再次使用PBS洗涤后加入0.1%结晶紫染液染色10min，观察迁移细胞数。采用预冷培养液稀释Matrigel基质胶后加入上室(40μl/孔)，将其放入培养箱内孵育5h后加入各组T24细胞悬液，后续实验步骤同细胞迁移实验，观察侵袭细胞数。
1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率取各组T24细胞加入0.25%胰蛋白酶消化，经3000r/min离心6min(离心半径10cm)后弃上清，加入预冷PBS洗涤后弃上清，向细胞沉淀中加入500μl结合缓冲液重悬细胞，分别将5μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素与5μl碘化丙啶加入细胞悬液后室温孵育10min，于1h内应用FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.6双荧光素酶报告基因实验检测LncRNAMINCR与miR-876-5p的靶向关系Starbase预测显示LncRNAMINCR与miR-876-5p存在结合位点，将含有结合位点与突变位点的片段克隆至pmirGLO载体得到野生型载体LncRNAMINCR-WT与突变型载体LncRNAMINCR-MUT，miR-NC、miR-876-5pmimics分别与LncRNAMINCR-WT、LncRNAMINCR-MUT共转染入T24细胞，于培养箱内继续培养24h后收集细胞，应用酶标仪检测萤火虫与海肾荧光值，以海肾荧光值为内参。
1.2.7蛋白质印迹法检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表达取各组T24细胞加入RIPA裂解液裂解后置于冰上孵育30min，3000r/min离心5min(离心半径10cm)后取上清并检测上清液蛋白浓度，将上样缓冲液加入蛋白样品中，置于沸水中煮10min蛋白变性，取50μg蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜后室温封闭2h，加入稀释比为1∶1000的CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleavedcaspase-3与内参β肌动蛋白一抗后4℃孵育24h，使用TBST洗涤后加入稀释比为1∶5000的二抗室温条件下孵育1h，滴加增强型化学发光试剂，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3统计学处理应用SPSS21.0统计软件分析数据。计量资料以x珋±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1膀胱癌细胞系中LncRNAMINCR和miR-876-5p表达情况与SV-HUC-1细胞比较，膀胱癌细胞系T24、RT4、UM-UC-3中LncRNAMINCR的表达水平均升高[(2.25±0.20)、(1.84±0.18)、(1.61±0.12)比(1.00±0.10)]，miR-876-5p的表达水平均降低[(0.38±0.03)、(0.46±0.04)、(0.51±0.05)比(1.02±0.12)](均P<0.05)，其中膀胱癌细胞T24中LncRNAMINCR的表达水平相对较高，因而选用T24进行后续研究。
2.2LncRNAMINCR低表达对T24膀胱癌细胞的影响与si-NC组比较，si-MINCR组细胞增殖活力降低，迁移及侵袭细胞数减少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleavedcaspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。见表1。
2.3miR-876-5p高表达对T24膀胱癌细胞的影响与miR-NC组比较，miR-876-5p组细胞增殖活力降低，迁移及侵袭细胞数减少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleavedcaspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。见表2。
2.4LncRNAMINCR靶向miR-876-5p与miR-NC组比较miR-876-5p组miR-876-5p过表达可明显降低野生型载体LncRNAMINCR-WT的荧光素酶活性[(0.46±0.04)比(1.00±0.10)](t=15.041，P<0.001)，而对突变型载体LncRNAMINCR-MUT的荧光素酶活性无明显影响[(0.99±0.09)比(1.02±0.11)](t=0.633，P=0.536)。与pcDNANC组比较，pcDNA-MINCR组miR-876-5p的表达水平降低[(0.38±0.03)比(1.00±0.10)](P<0.05);与si-NC组比较，si-MINCR组miR-876-5p的表达水平升高[(1.75±0.15)比(1.02±0.11)](P<0.05)。
2.5低表达miR-876-5p可以逆转LncRNAMINCR低表达对T24增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响与anti-miR-NC组比较，anti-miR-876-5p组细胞活力升高，迁移及侵袭细胞数增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(均P<0.05);与si-MINCR+anti-miRNC组比较，si-MINCR+anti-miR-876-5p组细胞活力升高，迁移及侵袭细胞数增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleavedcaspase-3蛋白水平降低(均P<0.05)，见表3、图1。
3讨论
LncRNAMINCR可激活Wnt/β-catenin信号，促进口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移[7]。LncRNAMINCR促进肝细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭[8]。LncRNAMINCR通过miR-223/ZEB1轴调节鼻咽癌细胞的辐射抗性[9]。但LncRNAMINCR在膀胱癌细胞中的表达尚未可知。本研究结果显示，膀胱癌细胞中LncRNAMINCR的表达水平升高，提示LncRNAMINCR在膀胱癌发生过程中可能发挥类癌基因作用。CyclinD1在膀胱癌组织或细胞系中表达水平升高，并可促进细胞周期进程，促进细胞增殖[10]。本研究结果显示，抑制LncRNAMINCR表达可明显降低膀胱癌细胞增殖活力及CyclinD1蛋白的表达水平，提示抑制LncRNAMINCR表达能够抑制膀胱癌细胞增殖。MMP-2、MMP-9在膀胱癌中表达水平升高，并可通过降解细胞外基质沉积从而促进细胞转移[11]。本研究结果显示，抑制LncRNAMINCR表达可明显减少膀胱癌迁移及侵袭细胞数并可降低MMP-2、MMP-9的表达水平，提示抑制LncRNAMINCR表达能够抑制膀胱癌细胞迁移及侵袭。线粒体途径激活后可释放细胞色素C，进而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶级联反应，半胱氨酸蛋白酶3是细胞凋亡执行因子，其被激活后形成Cleaved-caspase-3进而诱导细胞凋亡[12]。本研究结果显示，抑制LncRNAMINCR表达可明显提高膀胱癌细胞凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平，提示抑制LncRNAMINCR表达能够促进膀胱癌细胞凋亡。
为进一步探究LncRNAMINCR在膀胱癌发生及发展过程中的可能作用机制，本研究证实LncRNAMINCR可充当miR-876-5p竞争性内源RNA分子，并可负向调控miR-876-5p的表达。miR-876-5p在胃癌细胞中呈低表达，circHIPK3/miR-876-5p/PIK3R1轴促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭[13]。miR-876-5p通过靶向TFAP2A抑制乳腺癌的进展[14]。miR-876-5p通过靶向c-Met抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[15]。LncRNAMCM3AP-AS1/miR-876-5p/WNT5A轴调节前列腺癌细胞的增殖[16]。本研究结果显示，膀胱癌细胞中miR-876-5p的表达水平降低，进一步研究发现miR-876-5p过表达可降低细胞活力并减少迁移及侵袭细胞数，而提高细胞凋亡率，提示miR-876-5p过表达可抑制膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭，并可促进细胞凋亡。同时本研究结果显示抑制miR-876-5p表达可明显降低抑制LncRNAMINCR表达对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用。
综上所述，膀胱癌细胞中LncRNAMINCR的表达水平升高，而miR-876-5p的表达水平降低，抑制LncRNAMINCR表达可通过上调miR-876-5p而抑制膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭，并可诱导细胞凋亡，LncRNAMINCR/miR-876-5p可作为膀胱癌治疗的潜在靶标，还可为进一步阐释膀胱癌的发病机制奠定实验基础。——论文作者：徐林飞张海涛刘晟蔡海荣胡恩平
