摘要:骨髓间充质干细胞在体内所处的力学环境比较复杂，为了探索生物力学与骨髓间充质干细胞增殖分化之间的关系，对近年来生物力学微环境对骨髓间充质干细胞增殖分化影响的研究现状和最新进展进行了综述。认为牵张力与流体剪切力对骨髓间充质干细胞产生的刺激大部分会使其向成骨方向分化，而较大的压缩力和静水压力对骨髓间充质干细胞产生的刺激大部分会使其偏向软骨方向分化，小部分向成骨方向分化，每种分化方向都有其最适的分化条件。通过综述生物力学对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响，为骨髓间充质干细胞的骨组织工程与再生医学研究及更好地应用于临床治疗提供思路和参考依据。
关键词:骨髓间充质干细胞;生物力学;增殖;分化
骨髓间充质干细胞(bonelessmarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一类具有自我增殖、多向分化潜能的干细胞，具备免疫源性低、方便取材、来源广泛等优点，常用于细胞组织移植、心血管疾病、骨缺损修复等多个领域[1-2]。研究认为BMSCs在生长过程中可感知不同的生物力学信号，从而影响细胞增殖、成骨分化等功能，而体内BMSCs的生长、成骨分化与骨组织的再生等也离不开复杂的力学作用环境[3-4]。目前已有相关力学对BMSCs影响的研究[5-6]，但采用的力学加载模式、时间、频率等皆不尽相同，且不同的作用力对BMSCs增殖、分化的影响不同。本文阐述了不同生物力学(牵张力、压力、流体剪切力)对BMSCs增殖与成骨分化的影响，及其可能作用的基因和信号传导通路等，为BMSCs的骨组织工程与再生医学研究及更好地应用于临床治疗提供参考。
1不同牵张力作用对BMSC增殖和成骨分化的影响
牵张力(mechanicaltensionstress，MTS)作为一个重要机械调节因素，对BMSCs起到拉伸应力作用[7]。目前国内外已有多种不同力学加载设备及力学刺激方式，其中研究较多的为牵张力。研究证实牵张力可有效促进细胞活性和功能，在骨再生和骨生物工程的临床应用中有重要指导意义[8]。但不同牵张力对BMSCs的增殖及成骨分化有不同的影响。
细胞的受力大小是无法测量出来的，只能间接通过硅胶膜的形变率、支撑物的上下运动位移来估计(根据牵拉头尺寸参数表计算，文中力的强度用百分数来表示)。黎润光等[9]参考Schaffer建模方法自行建立体外细胞周期性机械牵张力学装置，在1.0Hz的频率下，分别采用不同应力大小、不同时间的机械信号刺激，结果表明12%应力作用下增殖指数最高，可达到无应力状态下的1.86倍，而采用过强的牵张应力(18%)时，对细胞不具有促进增殖效应;同时，牵张力干预早期可以促进BMSCs增殖，干预时间超过48h反而表现为抑制生长状态。井燕等[10]采用双轴力学应变系统选取0.4%、1.0Hz频率、每天3次、每次2h、间隔2h的力学应变加载BMSCs，力学应变作用后细胞增殖指数(proliferationindex，PI)比相应静态组增高，动物骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)和碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)的表达均有明显升高，表明力学应变可以提高BMSCs的增殖和成骨分化能力。戚孟春等[11]采用四点弯曲加力系统施加的40min、0.2%机械牵张力作用于大鼠BMSCs，发现受力组在受力后细胞数明显高于对照组，BMSCs增殖活力显著增高并短暂性成骨向分化。通过加载机械张力，模拟骨组织受力情况发现，不同大小、时间、频率的机械张力均影响BMSCs增殖，大小适宜的机械张力可起到促进作用。
高莺等[12]同样采用四点弯曲加力系统对SD大鼠BMSCs施加0.2%机械牵张力，结果显示其细胞生长曲线与对照组相比差别不大，但骨钙素表达水平和ALP活性显著增高，且芯片杂交检测的差异表达基因数量变化明显。薛令法等[13]采用Flexcell体外细胞力学加载装置，施加0.5Hz频率、0.8%形变率、每天2次、每次30min的间歇性牵张力，可促进小鼠BMSCs成骨分化。Wu等[14]通过Flexercell-5000给予人BMSCs机械拉伸(10%，0.5Hz)，数据显示LncRNAH19通过上调下游FAK来介导牵张力诱导的BMSCs成骨分化。Jang等[15]采用单轴拉伸应力单元系统，分别以3%和10%拉伸力、0.26Hz频率给予兔源BMSCs循环张力，结果发现张力促进BMSCs增殖增加，并且10%牵张力趋向平滑肌细胞分化，3%牵张力趋向成骨细胞分化。Song等[16]采用自行组装的机械拉伸装置以1Hz频率、2%～8%拉伸15～60min，经MTT检测后显示牵张力具有促进BMSCs增殖的重要作用，且采用8%应变、60min拉伸处理的BMSCs细胞c-fos基因表达明显升高。通过以上研究发现，一定条件的周期性力学信号刺激可以促进BMSCs向成骨方向分化，但当拉伸幅度及作用时间不同时，可出现不同的细胞分化方向。
2不同压力作用对BMSCs增殖和成骨分化的影响
力学刺激对细胞功能及组织发育、重建等有重要影响作用，BMSCs受到多种应力作用，而压应力同样作为正常人体关节运动中的主要受力因素，亦可引起细胞生物力学特性的变化[17]，在研究中对BMSCs施以压应力(hydrostaticstress，HDS)能很好地模拟细胞的体内环境，同时又易于标准化和结果间的相互比较与分析[18]。
刘岩正等[19]采用自行设计的可控细胞液压加载装置给予BMSCs细胞相应的静压力刺激，结果表明采用90kPa静压力每天1h连续作用2d促BMSCs增殖与成软骨向分化的作用最显著，PCNA、SOX-9、AggrecanmRNA的表达均显著升高。何川等[20]采用自制加压装置给予BMSCs加载静水压，发现40kPa的静水压连续作用4d可以促进Cbfa1、OCmRNA表达，连续作用7d时仍对BMSCs表现为促成骨分化作用，在连续作用14d时，作用转变为促成脂分化。李正章等[21]采用自行改制的细胞压力加载装置进行力学干预BMSCs，结果显示分别在5.32、10.64、21.28kPa压力干预下细胞增殖指数均明显升高，MMP-2活性最低;而在29.26kPa压力下增殖指数则明显下降且死亡增多，基质金属蛋白酶2(Matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)活性增高。潘景光等[22]采用自行设计制作的细胞液压加载装置对BMSCs经动态压力处理后，在0～45kPa和0～90kPa动态正压作用下，BMSCs增殖活性显著增强，且与压力值呈正相关。但通过透射电镜观察细胞的超微结构发现0～45kPa动态压力作用下可促进细胞蛋白合成，而在0～90kPa动态压力作用下，细胞中出现了凋亡小体，证实在该压力作用下可诱导细胞凋亡。赵永亮等[23]采用Flexcell-5000基底压缩加载系统对BMSCs延迟性周期性压缩应力刺激(正弦波、0.5Hz、20kPa、2h/d压缩应力)，结果显示应力可促进Col2的表达，抑制ROCK通路，并可能通过ROCK通路调控BMSCs成软骨分化。易飞舟等[24]采用自主研发的细胞液压加载装置，分别对BMSCs加载持续静压力45、90kPa及周期性动压力0～45kPa、0～90kPa。数据显示90kPa静压作用下Sox9及Aggrecan基因的表达量显著高于0～90kPa，而0～45kPa压力促Sox9及Col2基因上调的作用则高于45kPa压力，且在持续90kPa的压力作用下BMCSs成软骨分化效果显著。当对BMSCs加载压力较小时，压应力可促进BMSCs增殖且向成骨方向分化，而当压力增大时BMSCs趋向成软骨方向分化。
3不同的剪切力作用对BMSCs增殖和成骨分化的影响
骨骼组织中的细胞在生理状态下，需要一定强度的流体剪切应力(fluidshearstress，FSS)的刺激，使其保持正常的生理功能，同时，培养液的流动也可对所培养的细胞产生流体剪切应力[25]，有研究表明，一定范围的流体剪切应力可以刺激BMSCs细胞的分化及增殖，保持细胞正常的生理功能[26-27]。
李洪鹏等[28]采用自制平行平板流动腔对BMSCs加载0.3Pa的流体剪切力刺激30min，结果表明流体剪切力可提高BMSCs细胞早期的细胞内ALP含量，细胞开始向成骨细胞分化，但未能促使晚期的骨钙素表达升高，说明此强度的流体剪切力不能成功促进人BMSCs最终实现向成骨方向分化。李立等[29]将BMSCs置于平行板流动腔内，以0.8Pa切应力条件下诱导24h，发现BMSCs可转化成内皮细胞。Kreke等[30]以0.16Pa的流体剪切力作用于大鼠BMSCs细胞，在成骨诱导培养液(地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸)中培养，在第6、8、10和12d检测时，流体剪切力促进了骨唾液酸蛋白(Bonesialoprotein，BSP)和骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)的表达，促进了OPN蛋白的积累，抑制了脂蛋白脂肪酶(Lipoproteinlipase，LPL)的表达;在第20d检测30min的加载力下，OPN及BSPmRNA的表达水平达到最高，同时，持续120min时成脂标志物脂蛋白脂肪酶的表达最少。刘立跃等[31]发现以0.42Pa间歇性FSS培养的BMSCs则向成骨细胞分化明显，而0.42Pa持续性FSS和0.034Pa的FSS对BMSCs没有明显的诱导分化作用。Stavenschi等[32]将BMSCs在封闭环境中分别给予不同剪切力，发现剪切力可以促进成骨标志物Cox2、Runx2和OPN的mRNA表达上调，确定在BMSCs施加2Hz、2Pa、FSS时成骨标志物表达上调最明显。Huang等[33]发现适当的FSS单独处理可以使心肌细胞相关标记物的表达显著增加，诱导BMSCs向心肌细胞转化。由此可见，BMSCs的增殖和分化与流体剪切力的刺激有密不可分的联系，较低强度的流体剪切力对BMSCs的影响并不大，较高强度的流体剪切力会抑制细胞的成骨分化。
不同生物力学作用大小、频率、作用时间等对BMSCs增殖和成骨分化的影响，以及相关的作用基因，如表1所示。牵张力一般在24h内，拉伸幅度为12%以下时，主要通过影响ALP、OPN、COLI、Ets1、Cbfa1、osterix、Runx2等基因，促进BMSCs增殖和成骨分化;压力范围在0～90kPa，每日加压时间在1～6h时，主要通过影响Cbfa1、OC促进BMSCs成骨分化;施加剪切力在0.3～2.0Pa，加载范围在0.5～2.0h时，主要通过ALP、OC、Runx2、OCN、COLIα等基因，促进BMSCs成骨分化。
4生物力学作用影响BMSCs增殖和成骨分化参与调节的信号传导通路
细胞感受力学信号，通过信号传导通路，影响基因的表达和蛋白质的合成[34]，机械刺激通过影响整合素表达，继而整合素将机械刺激转换为生物力学信号，实现对BMSCs的成骨分化调控。不同力学刺激BMSCs后，BMSCs的整合素α2β1、α5β1、αVβ3等表达量升高，同时以整合素为基础的FAK参与启动多条信号通路，通过调控不同的信号通路，进而促进与成骨分化相关基因表达。由此，多种细胞成分在信号传导中起到重要的作用，如细胞骨架、整合素、离子通道等方面参与机械力学信号转导[35]。
Simmons等[36]对人BMSCs施加0.25Hz、3%形变率的牵张力，激活了细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，同时发现p38信号通路在BMSCs应变诱导成骨分化的调控中起抑制作用。刘小雅等[37]采用Flexcell细胞力学加载装置对小鼠BMSCs施加0.5Hz、0.8%振幅的机械牵张力，结果表明在持续牵张力作用下可通过p38MAPK通路向成骨细胞分化。由此可见，小幅度的牵张力能通过p38MAPK信号通路促进BMSCs成骨分化。赵闯等[38]通过自行研制的细胞加载装置对BMSCs施加机械张应力0.25%、加力60min，提示牵张力加载激活了Wnt信号3个关键分子Wnt3A、β-catenin与Lef-1，并刺激BMSCs增殖与骨向分化过程。另有研究者用Flexcell应变装置对大鼠BMSCs给予机械张应力10%、0.5Hz频率，每日2次循环拉伸刺激，通过短干扰RNA下调Cbfa1基因表达后，成骨标记物表达出现下降，证明了牵张力刺激可能通过ERK1/2激活的Cbfa1信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化[39]。同时，研究表明整合素FAK信号通路参与了机械牵张诱导BMSCs成骨分化的调节，整合素介导的FAK活化后，Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-PI3K-Akt等信号通路可能进一步激活，调控细胞功能[40]。
杜静等[41]采用自主研发的静态液压加载装置对兔BMSCs加载120kPa、每天1h、连续4d的力学刺激，结果显示压力刺激后，BMP2及Smad1/Smad5表达明显上调，同时促进BMSCs软骨方向的分化。陈骥等[42]采用自行设计制作的可控细胞液压加载装置给予90kPa压强加载1h，提示压力可以通过激活RhoA的活性可促进DNA合成及细胞增殖，并在成骨诱导早期，依赖RhoA活性，压力可促进BMSCs成骨分化，而在成骨诱导晚期，RhoA活性抑制，OPN下调，压力对成骨分化晚期起抑制作用。另有研究者采用可控细胞液压加载装置对大鼠BMSCs施加90kPa流体静压力，结果显示BMSCs中Sox9、Aggrecan及ColII的mRNA表达量增加，且Rac1在流体静压力导致的细胞成软骨分化过程中亦具有调控作用[43]。此外，静水压力还可通过Wnt-RhoA-ROCK调节BMSCs，进而影响早期成骨分化标志物基因的表达[44]。
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研究者使用平行板培养箱研究剪切应力对人BMSCs成骨分化的调节能力，结果显示在1.2Pa的流体剪切应力作用下，在一段时间内对Cbfa1/Runx2基因的表达有影响，而BMSCs的成骨活性迅速增强，I型胶原基因的表达下降，这些效应依赖于p38和ERK1/2的激活[45]。同时，Liu等[46]证实通过信号通路，间歇性流体剪切力可以诱导人BMSCs成骨分化。首先β1整合素感知细胞外间歇性FSS的刺激后，通过激活FAK活化ERK1/2导致Runx2磷酸化，磷酸化的Runx2启动成骨基因的转录，进而促进BMSCs向成骨细胞分化;其次，间歇性FSS激活的ERK1/2通过激活NF-κB增加BMPs的表达，BMPs的增加导致BMP/Smad通路的激活，最终导致Runx2的表达;再次，间歇性FSS激活的ERK1/2通过介导NF-κB的活化影响β1整合素的表达。——论文作者：曹盛楠1，2a，2b，师彬2a，2b，孙国栋3，4，王从安2a，2b，王丹丹2a，2b*
