摘 要：应用主成分分析和聚类分析，从宏观和微观2个层面分析鉴别化橘红种质资源，以期为化橘红种质资源的鉴定、评价、保护、开发和利用提供参考依据。利用SPSS 19.0对化橘红种质资源17项主要植物学数量性状指标和 6 项理化指标进行变异性和主成分分析，采用 MEGA7 对 SNP 结果进行聚类分析。研究发现，不同化橘红种质资源在有效成分、花和叶片性状上变异明显;存在黄酮因子、果形因子等 6个主成分因子和柚皮苷、总黄酮、雌蕊粗度等12项影响力较大的指标;种质资源共聚为2类，不同聚类拥有各自性状特征。本研究分析化橘红种质资源的方法和结果，可为进一步系统评价化橘红种质资源提供参考。
关键词：化橘红;种质资源;主成分分析;聚类分析;评价
0 引言
化橘红(Citri grandis exocarpium)[1] 又称化州橘红、柚类橘红、柚皮橘红、毛橘红，广东化州道地药材，其名字中的“化”也取自广东化州，是芸香科柑橘属植物化州柚 (Citrus grandis‘Tomentosa’)或柚(Citrus grandis)的未成熟或近成熟的干燥外层果皮[1] 。研究表明，化橘红虽为柚类，但其化痰止咳、宽中消积的功效却远高于普通柚皮。化橘红始记于万历封年《高州府志》，素有“南方人参”、“一片值千金”的美称[2] 。近年来，化橘红的药效得到越来越多的认可，2006年获批中国国家地理标志保护产品，2016年入选为广东省第一批立法保护岭南中药材品种，2020年在新型冠状病毒肺炎临床治疗期的普通型中医治疗中，因对湿毒郁肺症有疗效被列入新冠肺炎诊疗组方用药[3] 。
目前，化橘红的研究主要集中在药理药效分析、病虫害防治、种质资源分析等方面[4-7] 。种质资源则主要利用红外线指纹图谱[8] 、随机扩增多态性[9] 、SNP 分子标记[10-11] 、ISSR分子标记[12] 等方法，对化橘红与其他柚类以及化橘红品种间进行分析鉴定。现有研究方法对化橘红种质资源鉴别比较单一，又因不同品系化橘红植株特征表型不明显，非专业人员难以凭肉眼准确区别，导致其难以为生产人员掌握。此外，同名异物、同物异名的情况也屡见不鲜，造成化橘红种质资源的收集、鉴定与保护工作受到极大限制。
种质资源的鉴定、保护和评价是种质资源育种和创新的基础。笔者以在化橘红地理标志产品保护范围内收集的11个种质资源为研究材料，借助经典的种质资源分析方法主成分分析和聚类分析，从植物学表型、遗传多样性、有效成分含量等多层面对种质资源进行综合分析，以期为化橘红种质资源鉴定、评价、保护、开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的 11 份化橘红种质资源为 2018— 2019 年收集于广东省茂名市化州化橘红地理标志产品 保 护 范 围 的 平 定 镇 、林 尘 镇 等 地 ，其 编 号 为 H1~H11，具体信息见表1。
1.2 方法
1.2.1 性状调查 基于《农作物种质资源鉴定技术规程柑橘》(NY/T 1486—2007) [13] 中种质资源植物学特性鉴定要求和方法，分别调查花、叶片和未成熟果实等17项主要植物学数量性状指标，具体性状和标准见表2。
1.2.2 化橘红主要成分的测定与进化分析 根据林励等[14] 、韩寒冰等[15] 等的研究结果，采收果龄55天的未成熟果实 10 kg，采用柴火法烘干成化橘红珠。再根据《地理标志产品 化橘红》(DB44/T 615—2017) [16] 理化指标和试验方法，测定化橘红珠总黄酮、柚皮苷、野漆树苷、挥发油含量，用UPLC法[17] 测定芹菜素含量，用气质联用法测定柠檬烯含量。
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本研究采集化橘红成熟春梢中部叶片采用CTAB 法提取 DNA，采用 PCR 产物的 SNP 分型高分辨率熔解曲线分析(resolution melting，HRM)[10] 法对11份化橘红种质资源的25个SNP位点进行基因分型，SNP引物序列见表3。
1.3 数据分析
用Excel 2013整理所有表型数据;用SPSS 19.0进行描述性统计和主成分分析，主成分法特征值大于1，最大方差法计算旋转载荷;利用 MEGA7 进行聚类分析，采用邻接法构建进化树，自检举1000次[18] 。
2 结果与分析
2.1 化橘红种质资源各指标的差异
由表4可以看出，23项主要植物学特征和理化指标中，野漆树苷变异系数最大，果横径变异系数最小。化橘红珠中除挥发油外，野漆树苷、芹菜素、柠檬烯、总黄酮、柚皮苷含量变异幅度大;花性状中雌雄蕊高低差、柱头纵径、柱头横径变异幅度较大，雄蕊数量、雌蕊粗度变异较小，雄蕊长度变异幅度中等;叶片性状中翼叶宽度变异幅度较大，叶片长度、叶柄长度、叶片宽度变异幅度中等;果实性状变异幅度均不大，但果形指数、果纵径较果重和果横径变异幅度大。结果表明 11 份化橘红种质资源在有效成分、花和叶片性状上变异明显，同一时期化橘红未成熟果质量相近，果纵径较果横径变异大，果形指数也相对存在较大变异。
2.2 化橘红种质资源主成分分析
为进一步明确各指标对11份化橘红种质资源的影响，对23项指标进行主成分分析。以Kaiser标准化的正交旋转法旋转后的旋转成分矩阵和特征值大于1 为标准，得到6个主成分因子(表5)。6个因子累计贡献率达92.092%，表明其可以代表23个指标的大部分变异信息。以各因子旋转成分矩阵中载荷绝对值大于 0.8为标准，可将23项指标简化为12项，筛选出影响力较大的12项指标分别为柚皮苷、总黄酮、雌蕊粗度、果纵径、果形指数、野漆树苷、柱头横径、挥发油、柠檬烯、雌蕊长度、雄蕊数量和囊瓣数。
如表5所示，第1主成分特征值为4.621，贡献率达 20.092%，柚皮苷、总黄酮、雌蕊粗度载荷绝对值较大，说明第1主成分以黄酮类成分和相关性状为主，称之为黄酮因子。第 2 主成分特征值为 3.908，贡献率达 16.992%，果纵径、果形指数、野漆树苷载荷绝对值较大，其中果纵径、果形指数为正向指标，野漆树苷为负向指标。第2主因子反映了化橘红的果形特性，称之为果形因子。第 3 主成分特征值为 3.745，贡献率 16.284%，柱头横径载荷绝对值较大，反映了柱头特性，称之为柱头因子。第 4 主成分特征值为 3.095，贡献率为 13.458%，挥发油、柠檬烯含量载荷绝对值较大，反映了化橘红挥发油含量，称之为挥发油因子。第 5主成分特征值为3.071，贡献率为13.352%，雌蕊长度载荷绝对值较大，反映了化橘红雌蕊特性，称之为雌蕊因子。第6主成分特征值为2.740，贡献率为11.915%，雄蕊数量、囊瓣数载荷绝对值较大，反映了化橘红结实特性，称之为结实因子。
2.3 化橘红种质资源聚类分析
采用生物进化距离法对11份种质资源进行聚类分析，结果如图 1 所示，11 份种质资源共分为 2 个分支，按每个分支为一大类。第Ⅰ类包括 H1、H3、H4、 H5、H7、H8、H9、H10和H11 9种种质资源，第Ⅱ类只包括H2、H6 2种种质资源。其中，第Ⅰ类进一步细分为 ⅰ和ⅱ，第ⅰ亚类包括5个种质资源，第ⅱ亚类包括4 个种质资源。结合主成分分析中筛选出的12个影响力较大的性状进行性状变异分析(表6)发现，第Ⅰ类中，第ⅰ亚类大部分性状较一致，野漆树苷变异最大;第ⅱ亚类各性状较一致，总黄酮、柚皮苷、野漆树苷相对变异较大。第Ⅱ类大部分性状表现较一致，野漆树苷、柠檬烯相对含量、柱头宽度变异较大。对各类别进行性状比较分析发现，与第Ⅰ类相比，第Ⅱ类化橘红种质资源雌蕊长度较短，但雌蕊粗度较大，柱头较宽，总黄酮、柚皮苷、野漆树苷含量高，挥发油和柠檬烯相对含量低。第I类中2个亚类间性状也有差异，与第ⅰ类相比，第ⅱ类化橘红种质资源雄蕊数量较低，雌蕊长度较长，柱头较宽，果纵径较长，囊瓣数较少，总黄酮、柚皮苷含量、柠檬烯相对含量偏高，但野漆树苷和挥发油较低。由此可见，不同类别化橘红种质资源在植物学表型和理化性状2个方面存在较大差异。
3 结论
主成分分析和聚类分析是开展植物质量评价[19-20] 、评价群体多样性[21] 、农艺性状[22] 、结构和功能特性[23] 、种质资源[24] 等研究的重要方法。本研究首次在化橘红中，利用主成分分析和聚类分析方法对11份化橘红种质资源进行评价鉴别，根据贡献率大小筛选得到黄酮因子、果形因子、柱头因子、挥发油因子、雌蕊因子、结实因子6个主成分因子，柚皮苷、总黄酮、雌蕊粗度、果纵径、果形指数、野漆树苷、柱头横径、挥发油、柠檬烯、雌蕊长度、雄蕊数量、囊瓣数影响力较大的 12 个指标。这些因子和指标包括了大部分花、果相关性状和有效成分，能较客观反映化橘红种质资源的特征特性，可作为鉴别化橘红种质资源时取舍性状的参考依据。
研究发现，不同化橘红品种雌蕊粗度、果纵径等主要植物学数量指标间存在差异，不同聚类化橘红主要理化指标间存在差异，该结果与林励等研究结果相符[11,14,25-26] ，同时本研究基于主成分分析结果发现，不同聚类化橘红种质资源主要植物学数量指标间存在差异，为化橘红种质资源类别区分提供了更为直观的鉴别指标和更充分的证据。但因化橘红尚无人工选育品种，自然变异资源较少，本研究样本数量较少，需尽可能发现收集更多的样本，对化橘红种质资源进行更全面的分析。——论文作者：曹 征，陈国军，何春玲，曾祥有
