摘要：目的探讨一种适用于小体积生物物证检材的包装方式。方法选择M4型螺丝钉作为研究对象，经去污消毒处理，通过手握方式转移人体脱落细胞到其表面，对螺丝钉采用两种不同的包装方式(滤纸包裹和悬空固定)，经KingFisherFlex自动提取工作站进行DNA提取，从基因座等位基因检出情况、STR分型谱带峰高、均衡性等方面比较两种包装方式对螺丝钉上DNA检出率的影响。结果悬空固定包装螺丝钉实验组获得的STR分型谱带峰高、均衡性等方面均优于滤纸包裹包装实验组，其在基因座检出数量、分型完全相同样本数及有效分型样本数方面也多于滤纸包裹包装实验组。结论为降低微量生物检材DNA二次转移造成的损耗，提高小体积生物检材DNA的检出率，建议对小体积生物检材采用悬空固定方式进行物证包装。
关键词：法医遗传学;接触DNA;小体积生物检材;检出率
近年来，随着犯罪嫌疑人反侦查能力的增强，检出率较高的唾液斑类生物检材(烟蒂、瓶口处等)有时较难在犯罪现场发现和提取到，而接触痕迹类微量生物检材因其涵盖面广、依附性强、量小体微、不易消失和毁灭等特点而逐渐为现场勘查人员所重视，成为当前现场勘查的重点找寻和提取对象[1]。但小体积生物检材如胶皮、螺丝钉、线头、金属片等物品的STR基因分型有效检出率较低，张广峰等[2]认为这与微量生物检材中粘附可提取DNA的细胞量较少、易被污染有关。为提高微量生物检材在基层实战中的应用价值，有学者从不同拭子附着细胞释放DNA的效果[3]、DNA提取方法等方面做了相关研究[4-5]。但对小体积生物检材包装方式对DNA检验结果的影响，还未见有报道。
本文立足基层实战，探讨了悬空固定与滤纸包裹两种包装方式对小体积生物检材DNA检验结果的影响，希冀为这类检材的成功检验提供参考。
1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂
自动提取工作站及配套试剂(KingFisherFlex，长春博坤生物有限公司)、Veriti型PCR扩增仪与ABI-3500xL型基因分析仪以及GobalFilerTM试剂盒(LifeTechnologies公司，美国)。
1.2 样本制备
从商场购买60个全新螺丝钉(M4型)，规格为头部直径7.6mm，钉长13mm。用5%次氯酸钠溶液浸泡15min后，用水洗净，置超声波细胞破碎仪清洗30min，后置恒温烘箱中烘干，取出待用。
相关期刊推荐：《刑事技术》ForensicScienceandTechnology(双月刊)曾用刊名：刑事技术资料，1976年创刊，是综合性学术期刊，是国内介绍法庭科学技术的权威性杂志。读者对象主要为基层公、检、法、司部门的技术警察、干部、侦察员，以及解放军、武警、铁路、交通、民航、林业、厂矿企业保卫部门的工作人员，各公安院校和其他大专院校从事法医学、刑侦、法律工作的师生等。本刊目前涉及的学科有法医损伤学、法医物证学、法医分子遗传学、毒物学、痕迹检验、文学检验、指纹识别、微量物证检验、刑事照相、司法会计等专业。
一名已知DNA分型的男性志愿者，反复搓手2min后，分别将60个螺丝钉以一定的力度握于手心2min，持握过程中反复颠换螺丝钉的位置，保证手掌皮肤均匀接触螺丝钉。后将螺丝钉随机分为A、B二组，每组30个。A组采用滤纸包裹方式包装：每个螺丝钉均用干净滤纸包裹后封装至纸质物证包装袋中，包裹紧密程度以螺丝钉不会掉落为准，分别编为A1～30号。B组采用悬空固定方式包装：用胶带粘面粘取螺丝钉头部位置，固定于盒内，保证螺丝钉悬空固定于盒内，分别编为B1～30号。图1示两种包装方式。
1.3DNA提取
采用相同的脱落细胞粘取器(Ⅰ型，长春博坤生物有限公司)对A、B两组螺丝钉表面反复粘取20次,分别将粘取器上的粘取膜撕下，置于2.0mL离心套管中，加入400µL裂解液，于95℃恒温混匀仪中消化10min后，转移至KingFisherFlex自动提取工作站提取样本DNA，洗脱后终体积为20µL。
1.4STR复合扩增及检测分析
提取的模板DNA使用GlobalFilerTM试剂盒在Veriti型PCR扩增仪上扩增，PCR设置为微量生物检材扩增方式，10µL反应体系：DNA模板6µL;ReactionMix3µL;PrimerSet1µL，30个循环。扩增产物经ABI-3500xL型基因分析仪电泳分离和激光扫描分析，以GeneMapperID-X软件分型数据。
1.5STR分型结果分析与统计
通过GeneMapperID-X软件(分析阈值设定为200RFU)分别对A、B两组样本DNA检验结果的图谱进行分析，对STR分型中每个基因座等位基因峰高、峰高均衡性、检出基因座数量、等位基因丢失或非特异性插入等情况进行统计。检测的21个常染色体基因座若与已知分型完全一致，视为“完全相同”样本;与已知分型相比，21个基因座中若有10个及以上基因座等位基因相同，视为“有效分型”样本;若与已知分型等位基因相同的基因座数量<10，则视为“无结果”样本。
2 结果与分析
综合分析滤纸包裹(A组)和悬空固定(B组)两组样本，B组的STR分型准确性、峰的高低、均衡性均明显优于A组。结果详见表1，A组中，有7个样本21个基因座等位基因与已知男性DNA分型一致，检出率为23.3%;17个样本出现基因座等位基因丢失或非特异性插入现象;6个样本检出结果较差，未获得有效DNA分型谱带，如图2。B组样本中，有13个样本21个基因座等位基因与已知男性DNA分型一致，谱带峰高和均衡性也较好，检出率为43.33%，如图3;14个样本出现基因座等位基因丢失或非特异性插入现象;仅3例样本未获得有效DNA分型谱带。
3 讨论
根据洛卡德物质交换理论，物体间接触会使物质发生转移或互相留下某些成分，这是微量生物检材形成的基础，同时也是DNA发生二次转移的缘起[6]。基层实战中，经常可以发现一些体积小、无挥发和粘附性的固态生物物证，如纽扣、钥匙、刀片、螺丝(帽)、铁钉、弹珠、铁片、胶皮、电线、布片、纤维、毛发等小体积检材，通常包装该类生物检材的方式是用滤纸包裹后放入纸质物证袋内，或者根据物证的不同材质选择不同物证包装盒进行包装，物证送至检验部门后，检验之前需打开包装进行状态核查和拍照留证。这一系列操作过程极易导致小体积生物检材表面附着的接触细胞再次发生转移和损耗[7-8]，这可能是小体积生物检材在基层实战中检出率较低的原因之一。因此，如何选择小体积生物检材的包装方式提高小体积生物检材检出成效成为基层实战中的重要课题。
本研究选取了60个小体积的M4螺丝钉作为研究对象，重点观察滤纸包裹和悬空固定两种包装方式对样本DNA检验结果的影响，实验结果表明：悬空固定包装组在STR谱带峰高和均衡性等方面优于滤纸包裹包装组，分型完全相同的样本数量多于滤纸包裹包装组，而无分型结果样本数少于滤纸包裹包装组。两组均有部分样本出现STR基因座等位基因丢失或非特异性插入情况，悬空固定包装组基因座出现该情况的累计有55个，表现在D18S51、TH01、D7S820、D2S1338等基因座，而滤纸包裹包装组累计有79个，表现在D2S1338、FGA、TPOX、D12S391及CSF1PO等基因座,这可能与本实验设计中对检测数据分析设定的分析阈值(200RFU)高于行标且未进行多次平行扩增实验，导致部分基因座谱带峰值低于分析阈值而未标记有关。等位基因丢失或非特异性插入以大片段基因座较为多见，这可能是因为本试验未对样本进行DNA定量分析，选择了实验室微量生物检材的扩增模式(6µL样本体积，30循环)进行PCR扩增反应，引物与模板在长片段基因序列处更容易造成错配，导致大片段基因座出现非特异性扩增现象较为突出。
根据本研究结果，悬空固定包装方式对螺丝钉的DNA检验结果优于滤纸包裹包装方式，这可能与悬空固定包装方式能有效减少螺丝钉与其他客体(滤纸、包装袋)表面发生接触，最大程度地减少了接触细胞的二次转移有关。对微量生物检材尤其是小体积生物检材，采用滤纸包裹包装虽然便捷，但容易造成微量生物检材中所含的脱落细胞发生二次转移，使检出率下降。因此，为有效提高微量生物检材尤其是小体积生物检材的检出率，刑事技术部门应选择好检材的包装方式，因物制宜，针对不同形状的检材，设计不同的包装方式，尤其是对小体积类型的微量生物检材，在包装方式上更要避免客体接触和反复拆装。悬空固定的检材还要避免运输中的激烈震动，防止造成检材的污染。——论文作者：徐海军1，叶志鹏1，钱利峰1，朱文浩1，霍塞虎2
