摘要：目的通过研究环状RNAcircAKT3对骨肉瘤细胞生物学行为的影响，来明确circAKT3在骨肉瘤进展中的作用。方法将骨肉瘤细胞分为实验组和对照组，实验组转染circAKT3的siRNA序列，对照组转染siRNANC(negativecontrol)序列。采用qRT?PCR验证转染效果，后续采用CCK?8实验检测两组细胞的增殖能力，采用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率，采用Transwell侵袭和迁移实验分别检测两组细胞的侵袭和迁移能力。采用qRT?PCR检测患者骨肉瘤及瘤旁组织中circAKT3的表达水平，然后分析骨肉瘤组织中circAKT3的表达水平与骨肉瘤患者临床相关病理参数的相关性。结果qRT?PCR检测结果显示，实验组SOSP?9607细胞中circAKT3的表达水平较对照组明显降低(P<0?001)。CCK?8实验和流式细胞仪凋亡检测结果显示，实验组SOSP?9607细胞的增殖能力较对照组明显降低(P<0?05)，而凋亡率则明显升高(P<0?001)。Transwell结果显示，实验组SOSP?9607和U2OS细胞的侵袭和迁移能力较对照组明显降低(P<0?01)。骨肉瘤组织内circAKT3的表达水平较瘤旁组织明显升高(P<0?01)。骨肉瘤组织内circAKT3的表达水平与患者的临床分期和转移呈正相关(P<0?05)。结论circAKT3可以增强骨肉瘤细胞的恶性生物学行为，促进骨肉瘤的进展。
关键词：环状RNA;circAKT3;骨肉瘤;增殖;凋亡;侵袭;迁移
作为最常见的恶性骨肿瘤之一，骨肉瘤主要发生于儿童和青少年[1，2]。骨肉瘤具有高度侵袭性，很容易出现早期转移[3]。近年来，虽然新辅助疗法和辅助化疗已在临床中广泛使用，但是仍不能完全抑制肿瘤的生长，使骨肉瘤的死亡率依然处于较高水平[4]。因此，在针对骨肉瘤的治疗中，迫切需要发掘新的治疗手段和靶点。
环状RNA(circularRNA，circRNA)是一类新的非编码RNA分子，其广泛存在于真核细胞的细胞质中[5]。不同于线性RNA分子，circRNA作为环状闭合分子，具有高度的稳定性[6]。circRNA具有多种功能，例如调节剪接和转录，结合蛋白以及转运RNA[7，8]。最近的研究表明，众多circRNA在多种肿瘤中表达异常，且其异常表达与肿瘤的进展密切相关，在肿瘤中充当癌基因或抑癌基因[9]。作为circ?RNA家族中的一份子，circAKT3可促进胃癌和肺癌的进展[10，11]。在之前的研究中，我们在细胞层面证实，circAKT3可促进骨肉瘤U2OS细胞的增殖和抑制细胞凋亡[12]。骨肉瘤作为具有高度侵袭能力的恶性肿瘤，circAKT3是否可以抑制骨肉瘤侵袭和转移，具有重要研究意义。除了在U2OS细胞系，在其他骨肉瘤细胞系是否具有同样作用，且其在临床层面是否同样具有癌基因作用，都需要进一步去研究。本实验就以上问题进行了验证，旨在进一步明确circAKT3在骨肉瘤中的癌基因作用，也为临床骨肉瘤的治疗提供可靠有效的治疗靶点。
1方法和材料
1?1临床标本采集
2016年3月至2018年12月在唐都医院骨科收集42例骨肉瘤组织标本以及10例相应瘤旁组织标本，术前均征得患者同意并签署同意书，患者术前均未进行过放化疗。标本取出后，立即放入-80℃进行保存。
1?2细胞系及培养条件
骨肉瘤SOSP?9607细胞系由唐都医院骨科建立，并在骨科骨肿瘤研究所进行保存[13]。U2OS细胞系购于ATCC(Americantypeculturecollection，美国模式培养物集存库)。SOSP?9607细胞系采用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI?1640培养基(美国Hyclone公司)进行培养，而U2OS细胞系则采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Hyclone公司)进行培养。所有细胞均在37℃、含有5%CO2浓度的饱和湿度的细胞培养箱(美国Thermo公司)内进行培养。
1?3细胞转染及分组
根据LipofectamineTM2000的操作手册对骨肉瘤SOSP?9607和U2OS细胞的circAKT3siRNA序列及siRNANC(negativecontrol)序列进行转染，转染均在6孔板(美国Corning公司)内进行。circAKT3的siRNA序列和siRNANC序列购至广东锐博生物科技有限公司。
后续将骨肉瘤细胞分为实验组和对照组，实验组细胞转染circAKT3的siRNA序列，而对照组细胞则转染siRNANC序列。
1?4qRT?PCR检测骨肉瘤组织及细胞中circAKT3的表达水平
采用TRIzol溶液(美国Sigma公司)对骨肉瘤组织和细胞进行裂解，其中在SOSP?9607细胞转染效率的验证部分，在细胞转染24h后进行裂解。在获取细胞和组织内的RNA后，采用5×All?In?OneRTMasterMix试剂盒进行反转录，从而获得相应的cDNA。最后采用EvaGreenExpress2×qPCRMasterMix试剂盒进行qPCR。引物序列如下：circAKT3上游5′-TCCAAATAAACGCCTTGGTGG-3′，下游5′-CCTCAGAGAACACCCGCTCT-3′;GAPDH上游5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游5′-ATCC?GTTGACTCCGACCTTCAC-3′。
1?5CCK?8实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力
待两组细胞转染24h后，将细胞铺于96孔板，每孔4000细胞，每组每个时间点铺8复孔，共铺4板，分别用于铺板后24，48，72，96h的检测。在检测前，每孔加入10μlCCK?8溶液(日本同仁公司)，然后将孔板置于细胞培养箱1h，最后上机检测两组细胞在450nm波长处的光密度值(opticaldensity，OD)。1?6流式细胞仪凋亡检测实验检测骨肉瘤细胞的凋亡率采用AnnexinⅤ?FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝公司)进行检测。待两组细胞转染48h后，1ml的1×BindingBuffer重悬细胞两次，取100μl细胞悬液加入实验管中，加入5μlAnnexinⅤ?FITC溶液后，室温下避光孵育10min。每管中继续添加5μlPI溶液，室温下避光孵育5min。添加预冷PBS将每管补至500μl后上机检测。
1?7Transwell侵袭实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力
待Matrigel基质胶(美国BD公司)融化后，采用OPTI?MEM(美国Gibco公司)培养基进行1∶8稀释，然后取50μl稀释后基质胶铺于Transwell小室(美国Corning公司)内，全程在冰上进行，铺胶后十字摇晃，以保证铺胶均匀。然后将铺胶后小室置于细胞培养箱中放置1h，此时基质胶会发生凝固。
相关期刊推荐：《山西医科大学学报》JournalofShanxiMedicalUniversity(月刊)曾用刊名：山西医学院学报，1959年创刊，医学类综合性学术刊物，主要刊登基础医学、预防医学、临床医学方面的科研成果及工作经验。自创办以来，受到了医学教育界的广泛好评。主要刊登我校科技人员及校友在基础医学、预防医学、药学、临床医学等方面的科研成果及经验报告和综述等。
在细胞转染48h后，添加相应无血清培养基离心收集6孔板内实验组和对照组细胞，计数3次，取平均值，然后将5×104细胞悬浮细胞添加至Trans?well小室内，并添加相应无血清培养基将小室内体积补至200μl。然后在Transwell小室下孔板内添加600μl含有20%胎牛血清的相应培养基。
在细胞培养箱培养20h后，取出小室，棉签去除基质胶，然后采用95%乙醇固定10min，继续采用0?5%结晶紫溶液染色5min，最后在倒置显微镜下进行观察。
1?8Transwell迁移实验检测骨肉瘤细胞的迁移能力
除了Transwell小室不铺Matrigel基质胶，且在细胞培养箱培养12h后即取出小室进行观察外，余同Transwell侵袭实验。
1?9统计学分析
实验结果采用SPSS22?0软件(美国IBM公司)进行统计分析，并采用GraphPadPrism7?0进行作图。计量资料采用均数±标准差表示。CCK?8实验部分结果采用two?wayANOVA检验进行分析，42例患者骨肉瘤组织中circAKT3的表达水平与骨肉瘤临床相关病理参数的相关性实验部分结果采用Fisher确切概率法进行分析，10例骨肉瘤患者肿瘤及相应瘤旁组织中circAKT3表达水平检测结果采用pairedStudent?t检验进行分析，余实验结果采用two?tailedStudent?t检验进行分析。P<0?05被认为差异具有统计学意义。
2结果
2?1circAKT3的siRNA在骨肉瘤SOSP?9607细胞中转染效率的验证
qRT?PCR实验结果显示，实验组在转染cir?cAKT3的siRNA后，其细胞内circAKT3的表达水平较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0?001，见图1)，说明转染有效，可以用于后续实验。
2?2抑制circAKT3的表达可抑制骨肉瘤SOSP?9607细胞的增殖能力
CCK?8结果显示，实验组在转染siRNA抑制circAKT3的表达后，其细胞在72h和96h的增殖能力明显降低，差异有统计学意义(P<0?05，见图2)。
2?3抑制circAKT3的表达可增加骨肉瘤SOSP?9607细胞的凋亡率
流式细胞仪凋亡检测实验结果显示，实验组细胞的凋亡率较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0?001，见图3)。
2?4下调circAKT3表达可抑制骨肉瘤SOSP?9607和U2OS细胞的侵袭能力
Transwell侵袭实验结果表明，实验组在下调SOSP?9607和U2OS细胞内circAKT3的表达后，细胞的侵袭能力较对照组也明显降低，差异有统计学意义(P<0?01，见图4)。
2?5下调circAKT3表达可抑制骨肉瘤SOSP?9607和U2OS细胞的迁移能力
Transwell迁移实验的结果同Transwell侵袭实验一致，较之对照组，实验组细胞的迁移能力明显降低，差异有统计学意义(P<0?01，见图5)。
2?6circAKT3在骨肉瘤组织中表达明显增高
对10对骨肉瘤组织及相应的瘤旁组织进行circAKT3表达水平进行检测，结果显示，骨肉瘤组织中circAKT3的表达水平较瘤旁组织明显升高，差异有统计学意义(P<0?01，见图6)。
2?7circAKT3表达水平与骨肉瘤临床相关病理参数的相关性
实验选择42例骨肉瘤组织进行了circAKT3表达水平的检测，以其表达水平的平均值为标准，将其分为circAKT3高、低表达组，并分析了circAKT3的表达水平与骨肉瘤患者的年龄、性别、分期、大小及是否有转移等相关临床病理参数的关系。结果显示，circAKT3的表达水平与骨肉瘤患者的临床分期和转移呈正相关，即骨肉瘤高临床分期和发生转移患者的骨组织中circAKT3的表达水平更高(P<0?05，见表1)。
3讨论
随着circRNA在肿瘤中的研究已成为热点，越来越多的circRNA被证实参与了肿瘤的发生和发展，成为肿瘤治疗的潜在新的靶点，为肿瘤的治疗提供了新的思路[14]。日益增多的研究表明，circRNA在骨肉瘤中同样也作为肿瘤发生和发展的重要参与者。例如，circMYO10在骨肉瘤中高表达，其作为癌基因可促进骨肉瘤增殖、侵袭和迁移[15]。此外，circ-0100876在骨肉瘤中表达被抑制，低表达的circ-0100876在骨肉瘤中作为抑癌基因可抑制骨肉瘤的恶性生物学行为[16]。而在之前的研究中，circ?AKT3被证实可促进骨肉瘤U2OS细胞的增殖和抑制细胞凋亡[12]。本实验同样证实了circAKT3可以促进SOSP?9607细胞的增殖和抑制细胞凋亡，证实了circAKT3在骨肉瘤细胞系中作用具有一定普遍性。骨肉瘤作为高度侵袭性恶性肿瘤，很多患者在就诊时已经出现转移，如何抑制骨肉瘤转移具有重要现实意义。在本实验中，我们在SOSP?9607和U2OS细胞系中证实了circAKT3可促进骨肉瘤的侵袭和迁移，是骨肉瘤促转移的参与者。综上，我们在细胞层面证实了circAKT3在骨肉瘤增殖、凋亡、侵袭和迁移等多个生物学行为中的促进作用。
除了在细胞层面，实验在临床标本层面证实了骨肉瘤中circAKT3的表达水平明显高于其瘤旁组织，同样提示了circAKT3在临床中的癌基因潜质。后续通过分析42例骨肉瘤患者组织中circAKT3的表达水平，结果表明，circAKT3的表达水平与骨肉瘤的临床分期以及转移事件的发生呈正相关，明确了circAKT3在骨肉瘤临床中的癌基因角色。需要看到的是，虽然circAKT3在细胞层面可促进细胞增殖，但是在此次临床样本统计中，其高表达与肿瘤大小的差异无明显关系。考虑其一可能是样本例数不足，未能准确反映其相关性;其二可能受骨肉瘤患者的就诊时间影响较大，以致临床很难准确反映两者的相关性。综上，临床层面的研究结果同细胞层面研究基本相一致，都证实了circAKT3在骨肉瘤中的促进作用，两者的一致性，也证实了研究的可靠性。
随着对circRNA的研究日益深入，关于其下游作用机制的研究也越发深入。大量的miRNA被证实为circRNA的下游靶点，circRNA通过海绵吸附miRNA的作用已被广泛报道。例如，circ-0060428通过海绵吸附miR?375进而解除后者对基因RBPJ的抑制作用，最终促进骨肉瘤的进展[17]。同样，circHIPK3通过作用于miR?637/STAT3轴进而促进骨肉瘤转移[18]。而circAKT3是否同其他很多circ?RNA一样存在下游miRNA，需要进一步研究。
综上，在前期研究的基础上，本实验进一步在细胞层面证实了circAKT3可促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和抑制凋亡，此外，在临床标本层面中，骨肉瘤中circAKT3的表达水平与骨肉瘤的临床分期和转移事件发生呈正相关。本研究进一步证实了cir?cAKT3在骨肉瘤中的癌基因角色，为骨肉瘤的临床治疗提供了潜在有效的治疗靶点。——论文作者：张开亮1，2，韩康3，陈明2，信波4，李大河1
