摘要叶绿素荧光动力学过程与藻类光合作用过程密切相关，叶绿素荧光动力学法是探测活体藻类细胞的天然工具。与常用的压载水荧光素染色-显微镜检活体藻细胞计数相比，叶绿素荧光动力学法具有测量快速、灵敏度高、无需前处理等特点。海洋船舶压载水中存在大量死亡藻细胞和有色溶解有机物(CDOM)，荧光背景复杂，因此，获得不受荧光背景影响且能够准确表征活体藻细胞数的光合荧光参数，是叶绿素荧光动力学法直接测量压载水活体藻细胞数的关键。本文以死细胞和CDOM溶液模拟压载水的复杂荧光背景，以二氯苯基二甲脲(DCMU)胁迫条件模拟实际应用，研究了不同荧光背景下Fm、F0、[RCII]和Fv等多个光合荧光参数与活体藻细胞数之间的关系。结果表明：Fm、F0、[RCII]对活体藻细胞数的表征都不同程度地受死细胞数和CDOM浓度的影响，仅有Fv不受荧光背景的影响，相对标准偏差小于5%;在不同稀释液稀释活体藻细胞溶液实验中，Fv与活体藻细胞数均具有良好的线性相关性，相关系数R2可达0.98以上;在DCMU胁迫作用下，有且仅有Fv与活体藻细胞数呈良好的正相关性，相关系数为0.986。本研究结果证明了光合荧光参数Fv不受荧光背景干扰，是表征压载水中活体藻细胞数的最佳光合荧光参数。
关键词生物光学;压载水;活体藻细胞数;光合荧光参数;Fv;叶绿素荧光动力学
1引 言
船舶压载水是有害水生生物和病原体等外来物种传播最主要的介质之一[1]。为减少压载水排放造成的外来物种入侵，国际海事组织(IMO)于2004年制定了《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》，该公约中的D-2准则[2]规定小于50μm且大于10μm的存活水生生物的准许排放浓度为小于10mL-1，而在这个细胞尺寸范围内的优势物种为浮游藻类[3]。目前，国内压载水活体藻细胞数检测的主要方法为显微镜观察法，但该方法需要对压载水进行采样，再对样品进行复杂的前处理才可进行后续实验室镜检分析，耗时耗力，且会造成船舶延误等，因此急需一种对压载水中活体藻细胞数进行原位快速在线分析的有效方法。
叶绿素a是藻细胞的重要色素之一，大量的研究[4-5]证明叶绿素a的浓度与生物量具有正相关关系。早期常用萃取出的叶绿素a的浓度来表征藻类生物量，但这种检测方法繁琐且存在较大误差。而后，荧光光谱法的问世使得无需提取叶绿素a便可直接快速地测量其浓度从而估算出生物量。但是，叶绿素a分子在死亡细胞内保持完整的时间长达两周[6-7]，所以利用叶绿素a分析法监测压载水中活体藻细胞数会受环境中荧光背景的严重影响，使得监测结果往往比实际值偏高，且监测结果不稳定[8]。叶绿素荧光动力学方法[5]是近些年发展起来的新方法，该方法就是将藻液暗适应数分钟后进行饱和脉冲光诱导，在此过程中，叶绿素荧光强度先快速上升而后缓慢下降。而这一过程与藻类活体细胞的光合作用密切相关，因此，利用荧光动力学曲线可以快速无损地获取初始荧光强度F0、最大荧光强度Fm、可变荧光强度Fv、光化学产量Fv/Fm等多种光合荧光参数[9]。First等[5]率先利用基于荧光动力学曲线得到的光合荧光参数F0来表征叶绿素a的浓度，用Fv/Fm来表征生物活性，从而实现了压载水中活体藻细胞数的监测。该方法可以快速估计样品中叶绿素a的浓度以及生物体的整体生理状态，因此Stehouwer等[10]和国际海事组织(IMO)[11]建议将可变荧光测定法作为评估压载水的工具。但由于不同藻种之间的Fv/Fm存在很大差异[12]，而且水中营养物质匮乏会引起Fv/Fm值的波动[13]，因此该方法选用的光合荧光参数Fv/Fm不一定适用于表征压载水中活体藻细胞数。而且，压载水的成分复杂，含有有色可溶性有机物(CDOM)，游离态叶绿素以及叶绿素未分解的死细胞等会产生干扰活体藻细胞测量的背景荧光干扰物质，这些干扰物质是否会影响，以及是如何影响光合荧光参数表征压载水中活体藻细胞数的，还尚待研究。
本文以杜氏盐藻为研究对象，通过设置不同浓度的死细胞来模拟压载水中高浓度死细胞荧光环境，并通过设置不同浓度的CDOM溶液来模拟压载水中的其他背景荧光环境，从而观察光合荧光参数Fm、F0、Fv和[RCII]是否受复杂背景荧光的影响。此外，本文还在二氯苯基二甲脲(DCMU)胁迫条件下，验证了光合荧光参数Fm、F0、Fv和[RCII]对活体藻细胞数表征的有效性。观察不同实验条件下样品中各光合荧光参数的变化规律，筛选可有效表征压载水中活体藻细胞数的光合荧光参数，可为发展压载水活体藻细胞数叶绿素荧光动力学在线监测技术提供参考。
2材料与方法
2.1藻种的选择与培养
本实验所用藻种均为购于上海光语生物科技有限公司的杜氏盐藻(GY-H13Dunaliellasalina)，用F/2培养基进行接种。杜氏盐藻为海洋绿藻，在合适的培养条件下长势良好，适合实验室培养与研究。细胞尺寸为12～13μm，满足国际海事组织D-2排放准则中监测的浮游藻类的尺寸。将接种后的藻液置于MQD-S3R型恒温摇床培养箱中进行扩大培养，藻样的培养条件如下：光源为白色冷荧光灯管，设置温度为(25±1)℃，转速为120r·min-1，光照强度为120μmol·m-2·s-1，光暗时间比为12h…12h。保证藻液培养3d，以达到高活性状态[14]。实验前，将藻液暗适应10min。
2.2光合荧光参数的获取
通过FastRepetitionRatefluorometer(FRRf)测得不同实验条件下光强为0时的Fm、F0、Fv和功能吸收截面σPSII，然后利用公式[RCII]∝F0/σPSII[15]计算得到[RCII]。光合荧光参数如表1所示。
2.3活体藻细胞数的测量
荧光素二乙酸酯(FDA)和5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA)都是膜渗透性染料，本身无荧光，但它们一旦进入到活体细胞内，非特异性酯酶就会裂解染色剂的分子，从而产生不可渗透的荧光产物，在蓝光激发下可观察到绿色荧光。由于FDA和CMFDA具有相似的发射光谱，因此可以同时使用以增强活体细胞所发出的绿色荧光的稳定性[16]。
配制FDA储存液：取0.1gFDA粉末溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为50mmol·L-1的FDA准备液;取20μLFDA准备液，将其溶于980μLDMSO中，配制成浓度为1mmol·L-1的FDA储存液[17]。
配制CMFDA储存液：取50μgCMFDA溶于430μLDMSO中，配制成浓度为250μmol·L-1的CMFDA储存液[17]。
取1mL杜氏盐藻样品，向其中加入5μL浓度为1mmol·L-1的FDA和10μL浓度为250μmol·L-1的CMFDA，混合均匀，最终工作浓度分别为5μmol·L-1和2.5μmol·L-1[16]，避光染色10min。使用0.1mL浮游生物计数框、正置荧光显微镜(NikonNi-U)进行计数。
2.4CDOM溶液的获取
CDOM溶液来自实验室培养2个月以上的藻类混合液的过滤液。使用0.2μm混合纤维脂膜进行过滤，过滤两次，以确保所有藻细胞均被滤除。
3结果与讨论
3.1死细胞荧光干扰下光合荧光参数测量结果分析
为了研究压载水舱中含有的大量死亡藻类细胞是否会对光合荧光参数定量活体藻细胞数有影响，本文通过配制不同浓度的死细胞液来模拟压载水舱环境。将藻液于50℃水浴加热30min，得到死细胞液。用海水将死细胞液稀释成5个浓度梯度(2、4、8、16、32倍稀释)且体积相同的死细胞样品，然后将死细胞样品分别加入到活体藻细胞数相同的5个杜氏盐藻样品中，另设置一个加入相同体积海水的对照样，观察Fm、F0、Fv及[RCII]数值的变化。结果如图1所示，Fm、F0以及[RCII]都随着死细胞数的增多而呈上升趋势，有且仅有Fv不受死细胞的干扰，稳定在2.25～2.75之间。Fm、F0、[RCII]数值的相对标准偏差分别为135.58%、47.89%和48.07%，而Fv的相对标准偏差为4.83%，说明Fv的数值基本不随死细胞数的变化而变化，而Fm、F0、[RCII]数值波动较大。
3.2CDOM荧光干扰下光合荧光参数测量结果分析
压载水中CDOM等荧光物质的含量极高[18]，本文通过控制藻滤液的浓度来模拟压载水中CDOM浓度的变化，通过观察光合荧光参数的变化来判断光合荧光参数是否受CDOM浓度的影响。柳先平等[19]发现当CDOM的质量浓度低于75mg·L-1时，可以用水溶液的荧光峰强度(λex/λem=320/410nm)表示CDOM浓度。据此，本文采用F-7000荧光分光光度计测定藻滤液的荧光强度，进而计算得到藻滤液的CDOM浓度。将用海水稀释的5个浓度梯度且体积相同的CDOM溶液样品加入到活体藻细胞数相同的5个杜氏盐藻样品中，同样设置一个对照样并加入体积相同的海水。结果如图2所示，Fm、F0和[RCII]都随着CDOM浓度的升高而呈上升趋势，有且仅有Fv不受CDOM浓度升高的影响，保持在1.6附近。Fm、F0和[RCII]的相对标准偏差分别为26.01%、37.86%和37.06%，而Fv的相对标准偏差为1.84%，这说明Fv的波动范围最小，不受CDOM浓度的影响，而Fm、F0和[RCII]的波动幅度较大，受CDOM浓度的影响比较显著。
3.3不同稀释液下光合荧光参数对活体藻细胞数的定量结果分析
为了探究在压载水舱的复杂荧光环境下，光合荧光参数能否准确定量活体藻细胞数，本文用随机浓度的死细胞液、CDOM溶液以及二者的随机混合液来稀释活体藻细胞原液，观察活体藻细胞数呈梯度减小的情况下，哪个光合荧光参数能够精准定量活体藻细胞数。
分别以死细胞液、CDOM溶液以及二者随机混合液为稀释液将杜氏盐藻活细胞原液按比例进行稀释，稀释倍数分别为0、2、4、8、16，同样设置一组以海水为稀释液的对照组。结果表明：在背景干扰为零的情况下，Fm、F0、Fv和[RCII]都随活体藻细胞数的减少而下降，如图3(a)、(b)、(d)所示;与用海水稀释的杜氏盐藻样品的Fm、F0和[RCII]数值相比，用死细胞液和CDOM溶液稀释的杜氏盐藻样品的Fm、F0和[RCII]数值都显著上升，且Fm和F0随着活体藻细胞数减少而呈现上升趋势。如图3(c)所示，无论用何种溶液稀释，Fv不受死细胞和CDOM等荧光物质的影响，始终保持着随活体藻细胞数梯度减小而下降的趋势。
由图4所示的T检验结果可以看出：无论用何种溶液稀释得到的Fv值与用海水稀释得到的Fv的值之间不存在显著性差异，P值均大于0.05;而采用含有背景荧光的稀释液稀释的样品的Fm、F0、[RCII]与采用海水稀释得到的相应值之间存在显著性差异，P值均小于0.05。
由表2所示的相关性分析可知：当用海水稀释时，所有光合荧光参数都与活体藻细胞数有着良好的相关性，能够定量活体藻细胞数，甚至，Fm、F0和[RCII]对活体藻细胞数的定量更优于Fv对活体藻细胞数的定量;但当样品中存在大量死细胞和CDOM时，只有Fv和活体藻细胞数呈现出良好的正相关，能够定量活体藻细胞数。定量结果如图5所示，除去箭头指向的点以外，Fv与活体藻细胞数之间的线性关系稳定，线性关系式为y=0.002x-0.102(R2=0.983)，而Fm、F0以及[RCII]均因受死细胞和CDOM的影响而与活体藻细胞数无明显的线性关系。不同稀释液对线性关系式的影响不大，Fv能够精准定量活体藻细胞数。考虑到箭头指向点后，Fv与活体藻细胞数之间的线性关系不稳定，这是包装效应导致的[20]。包装效应会增加PSII荧光产生的光子在离开细胞之前的吸收，从而使得光合荧光参数的测量值相应降低。
3.4在DCMU胁迫作用下光合荧光参数随活体藻细胞数的变化规律
为了进一步验证光合荧光参数对活体藻细胞数的表征，在6个25mL杜氏盐藻原液样品中分别加入1mL质量浓度分别为5，10，20，40，50μg·L-1的DCMU样品，并配制对照样(加入1mL海水)，静置10min后测量其光合荧光参数。由图6可以看出，随着DCMU浓度增大，活体藻细胞数减少，Fv随着活体藻细胞数的减少而降低，而其他参数则随着活体藻细胞数的减少而增大，有且仅有Fv与活体藻细胞数呈现出相同的变化趋势。
如表3所示，Fv与活体藻细胞数有很强的正相关性，而其他参数则与活体藻细胞数呈现出负相关性。Fm、F0和[RCII]出现反常(随着活体藻细胞数的减少而增大)的原因是当PSII抑制剂(DCMU)不可逆地阻断一小部分反应中心时，随着荧光强度的增加，能量被重定向到另一个反应中心，并且能量直接重发射的概率增加，导致Fm和F0增大[21]。同时，DCMU阻断了一小部分反应中心导致σPSII下降，而F0上升，所以[RCII]也随着荧光强度的增加而增大。——论文作者：华卉1，2，3，殷高方1，3*，赵南京1，3**，甘婷婷1，3，陈敏1，2，3，王璐1，2，3，亓培龙1，2，3，王翔1，2，3，张小玲4，方丽1，3，杨瑞芳1，3，董鸣1，2，3，陈志浩1，2，3，贾仁庆1，2，3，丁志超1，2，3，刘建国1，3
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