摘要背景：肾俞、足三里为针刺治疗骨质疏松症的常用穴位，但其具体机制尚不明确。目的：基于骨组织Runt相关转录因子2启动子甲基化水平，探究电针肾俞、足三里等穴位对去卵巢骨质疏松症大鼠的疗效机制。方法：将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针穴位组、电针非穴位组、雌二醇组，每组10只。假手术组以外的4组大鼠采用去卵巢法建立骨质疏松症模型，电针穴位组选取肾俞、足三里穴位进行电针治疗，电针非穴位组选取非穴位处进行干预，其余3组不进行电针干预;雌二醇组给予雌二醇片(0.09mg/kg)灌胃治疗，假手术组和模型组均灌胃10mL/kg的生理盐水。干预12周后，测定各组大鼠右侧下肢股骨及椎骨骨密度、股骨生物力学性能、血清骨钙与Ⅰ型原胶原N端前肽表达水平、骨组织骨桥蛋白与骨唾液蛋白表达水平、骨组织Runt相关转录因子2启动子甲基化表达水平。结果与结论：①与假手术组相比，模型组大鼠股骨、椎骨骨密度明显下降(P<0.05);股骨最大载荷、刚度及弹性模量、血清骨钙、Ⅰ型原胶原N端前肽水平均明显下降(P<0.01);骨组织中骨桥蛋白和骨唾液蛋白、Runt相关转录因子2启动子CpG1和CpG2、CpG3和CpG4.5的表达明显上升(P<0.01);②与模型组相比，电针穴位组和雌二醇组对上述各指标改善明显(P<0.01);而电针非穴位组骨组织中Runt相关转录因子2启动子CpG1、CpG2、CpG3、CpG4.5的表达下降不明显(P>0.05)，此外其余上述指标均有所改善(P<0.05);③与雌二醇组相比，电针穴位组对血清Ⅰ型原胶原N端前肽水平的上调较为明显(P<0.05)，而其余指标差异无显著性意义(P>0.05);④提示电针肾俞、足三里穴位可通过降低骨组织Runt相关转录因子2启动子甲基化水平，增强骨密度，改善股骨的生物力学性能等，从而有效防治骨质疏松症。
关键词：电针;骨质疏松;表观遗传;甲基化;生物力学;大鼠;Runx2启动子
0引言Introduction
骨质疏松症是以患者单位体积内骨量减少为主要特点的代谢性骨病，中老年人为其常见患病群体[1]。作为骨质疏松症最常见、最严重的并发症，骨质疏松性骨折致残率高，是造成老年人生活质量下降的主要原因及常见的死亡原因[2-3]。调查显示，国内65岁以上居民的骨质疏松症患病率为32%[4]，而绝经后骨质疏松症占比最大[5]，临床上对绝经后骨质疏松症的治疗以雌激素替代疗法为主，但长期使用会增加女性患乳腺癌、宫颈癌等的概率[6]。
DNA甲基化所属的表观遗传修饰是一种重要的基因表达调控机制，异常的DNA甲基化在癌症、神经系统疾病、免疫疾病、骨质疏松症等许多疾病中存在，影响癌症形成和肿瘤进展[7]。现有研究表明，Runt相关转录因子2(Runtrelatedtranscriptionfactor2，Runx2)基因启动子甲基化水平的高低是成骨细胞分化和骨形成的重要影响因素，影响骨质疏松症的发生发展[8-9]。
相关期刊推荐：《中国组织工程研究与临床康复》1997年创刊，由中华人民共和国卫生部主管，中国康复医学会与《中国组织工程研究与临床康复》杂志社主办。发表组织工程研究中关于干细胞培养与移植、组织构建、材料生物相容性评价(天然或合成材料与纳米粒子、人工材料植入体、植入器官及外源性细胞)、计算机辅助骨外科技术的应用基础及临床研究，转化医学和循证医学研究的文章，发表中国组织工程研究领域一流水平的学术、技术创新成果。
基于中医“肾主骨”理论指导，针刺肾俞穴可培肾壮骨，固护人体先天之本，针刺足三里可健脾胃，固护后天之本，从而促进肾精形成[10]。故临床上通过电针肾俞、足三里穴位将补肾之法广泛运用于骨质疏松症的治疗中[11]，目前多数研究发现针刺肾俞、足三里等穴位能够刺激骨密度明显增加，改善骨骼的生物力学形态[12-13]，但具体机制不甚明确。而研究发现通过针刺肾俞、足三里能促进腰椎中Runx2mRNA表达[10]，由此推测电针肾俞、足三里可能通过影响Runx2基因启动子甲基化以防治骨质疏松症。
故此次研究基于骨组织Runx2基因启动子的甲基化修饰，探究针刺对去卵巢骨质疏松症大鼠的疗效机制。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计完全随机设计，动物实验，单因素方差分析和LSD检验。
1.2时间及地点于2018年12月至2019年12月在广州中医药大学动物实验中心完成。
1.3材料
1.3.1实验动物50只成年SD大鼠，SPF级，雌性，体质量160-220g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量生产合格证号：SCXK(粤)2018-0034。动物房温度为(21±3)℃，湿度50%。此次实验已通过广州中医药大学动物实验中心伦理委员会批准。
1.3.2仪器华佗牌电针仪(型号：SDZ-Ⅱ)，广东省普宁市普慈医疗器械有限公司;DexaPro-1型双能X射线骨密度仪，美国GE公司;AllegraX-15R型医用离心机，美国Beckman公司;JS-Power300型电泳仪，上海迪奥生物科技有限公司;ZF-208型凝胶成像，上海恒勤仪器设备有限公司;PIDRed96型PCR仪，美国ThermoFisherScientific公司。
1.3.3药品和试剂戊酸雌二醇片(廊坊高博京邦制药有限公司，批号：20181112，规格：2mg/片);血清骨钙、Ⅰ型原胶原N端前肽(totalprocollagentype1N-propeptide，P1NP)试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号：ZN1686238，ZN16730102);水合氯醛溶液(批号：jx-1480);二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(批号：jx-2468);聚丙烯酰胺凝胶试剂盒(批号：jx-2391);羊抗鼠骨桥蛋白一抗(批号：jx-2566);羊抗鼠骨唾液蛋白一抗(批号：jx-2686);甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(批号：jx-2583);实时荧光定量PCR试剂盒(批号：jx-2465)。
1.4实验方法
1.4.1动物分组、造模选择50只6月龄健康雌性SD大鼠，经1周的适应性喂养后，按随机数字表法分为5组，即假手术组、模型组、电针穴位组、电针非穴位组及雌二醇组，每组10只。假手术组以外的其余4组大鼠采用去卵巢法建立骨质疏松症模型[14]，麻醉后，在大鼠腰椎旁开1cm处，沿皮肤及肌肉纵向剖离1.5cm左右深度，在脂肪团中找到并切除双侧卵巢;假手术组采用同样的手术操作暴露但不摘除卵巢。5组大鼠术后每日均予腹腔注射10×104U青霉素，连续给药3d，防止感染。
1.4.2干预方法正常饲养术后大鼠，2个月后开始进行干预，连续干预12周。电针穴位组固定大鼠并进行常规消毒，参照《实验针灸学》选取肾俞、足三里穴位[15]，用0.35mm×25mm毫针平刺4.0-5.0mm后，连接电针仪，进行治疗，频率为2Hz，强度为1mA，连续波，每日早晚各1次，每次持续10min;电针非穴位组选取非穴位处(胁下髂嵴上20-25mm，后正中线旁开20mm处)，操作同电针穴位组;其余3组不进行电针干预，但予相同的固定操作。雌二醇组给予雌二醇片(0.09mg/kg)灌胃治疗[16]，1次d，给药12周;假手术组和模型组均灌胃10mL/kg的生理盐水，1次/d，给药12周。
1.5主要观察指标
1.5.1骨密度末次给药结束后24h，注射10%水合氯醛(3mL/kg)至腹腔，麻醉大鼠后，将大鼠右股骨、椎骨部位置于双能X射线密度仪器上检测骨密度。
1.5.2股骨生物力学性能将大鼠麻醉后断头处死，取各组大鼠完整的股骨，放置于生物力学万能实验机上，机器以2mm/min速度往下压，直至股骨断裂。采集数据，测得最大载荷、股骨刚度、弹性模量的数值。
1.5.3血清骨钙、P1NP的水平从大鼠的腹主动脉收集血液5mL，放置1h，以3000r/min离心10min，分离得到血清。按ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中骨钙、P1NP的表达水平。
1.5.4骨组织骨桥蛋白、骨唾液蛋白大鼠处死后，取右侧股骨洗净，取部分骨片研磨、提取蛋白，用二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品加到聚丙烯酰胺凝胶的孔内，每孔20μL，用280mA电流转膜1h。取出PVDF膜，TBST洗3次，5min/次，之后将膜放入5%的脱脂奶粉中，室温条件下封闭保存2h。封闭结束后，将膜取出，TBST浸洗3次，5min/次，加入骨桥蛋白、骨唾液蛋白的一抗(1∶1000)稀释液，4℃储存，过夜。加入二抗(稀释度为1∶200)，以ECL试剂盒显色后，置于凝胶成像系统上成像并采用ImageJv1.5.1软件分析，以相应蛋白与内参(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的灰度值比值表示该蛋白的相对表达量。
1.5.5Runx2启动子甲基化水平取双侧股骨头，除杂、清洗并干燥后，装入液氮冻存管，拧紧管盖，液氮速冻0.5h后，于-80℃冰箱中冻存。质谱法检测：①引物设计：检测部位为Runx2基因启动子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5(表1)。②引物设计完成后，再经过DNA提取(使用QIAGEN试剂盒提取骨组织DNA)、重亚硫酸盐处理、PCR扩增、碱性磷酸酶处理、体外转录(IVT)和RNase酶切、纯化，点样及质谱。
1.6统计学分析
运用统计学软件SPSS23.0对数据进行分析。以x-±s表示符合正态分布的计量资料，用单因素方差分析(OneWayANOVA)比较各组数据，组间两两比较则采用LSD检验。P<0.05表明差异有显著性意义。
2结果Results
2.1实验动物数量分析健康雌性SD大鼠共50只，随机分为5组，每组10只，实验过程中各组大鼠均无死亡。
2.2电针对骨质疏松大鼠股骨、椎骨骨密度的影响在大鼠股骨、椎骨骨密度方面，模型组显著低于假手术组(P<0.05);与模型组相比，电针非穴位组大鼠的股骨、椎骨骨密度显著升高(P<0.05)，而电针穴位组和雌二醇组升高更加明显(P<0.01)，但两组间比较差异无显著性意义(P>0.05)，见表2。
2.3电针对骨质疏松大鼠生物力学性能的影响由表3可知，在股骨最大载荷、股骨刚度、弹性模量方面，模型组显著低于假手术组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组比较，电针非穴位组股骨最大载荷、股骨刚度、弹性模量显著升高(P<0.05)，而电针穴位组和雌二醇组升高更加明显(P<0.01)。与电针非穴位组比较，电针穴位组和雌二醇组的股骨最大载荷、股骨刚度、弹性模量升高明显(P<0.05)。表明经过电针干预后，疗效明显。
2.4电针对骨质疏松大鼠骨钙、P1NP表达的影响在血清骨钙水平上，模型组显著低于假手术组(P<0.01);与模型组比较，电针非穴位组的表达升高(P<0.05)，电针穴位组和雌二醇组的表达升高更加明显(P<0.01)。与电针非穴位组比较，电针穴位组和雌二醇组的表达升高(P<0.05)，详见表4。
在P1NP表达方面，模型组显著低于假手术组(P<0.01);与模型组比较，电针非穴位组的表达升高(P<0.05)，电针穴位组和雌二醇组的表达升高更加明显(P<0.01)。与电针非穴位组比较，电针穴位组的表达升高(P<0.05)。和雌二醇组相比，电针穴位组升高更加明显(P<0.05)，详见表4。
2.5电针对骨质疏松大鼠骨桥蛋白、骨唾液蛋白表达的影响由表5及图1可知，在骨桥蛋白、骨唾液蛋白表达方面，模型组显著高于假手术组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组比较，电针非穴位组的表达降低明显(P<0.05)，而电针穴位组和雌二醇组降低更加明显(P<0.01)。表明经过电针干预后，疗效明显。
2.6电针对骨质疏松大鼠Runx2启动子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5表达的影响详见表6。
由表6可见，在Runx2启动子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5表达方面，模型组显著高于假手术组(P<0.01);与模型组比较，电针非穴位组的表达下降不明显(P>0.05)，电针穴位组和雌二醇组下降明显(P<0.05)。
3讨论Discussion
通过症状对比，骨质疏松症与中医学中的“骨痹”“骨痿”相似。《素问·阴阳应象大论》曰：“肾生骨髓，在体为骨”，肾精、气虚则骨髓不生，髓减则骨痿，故治疗多补肾益精[17]。足太阳膀胱经之肾俞穴，为肾气输注于背部之处,针之培肾壮骨，固护人体先天之本。《医宗金鉴》曰：“多气多血惟阳明”，足阳明胃经之足三里，为胃经之下合穴，针之健脾益胃，故针刺足三里能固护后天之本，补益气血，促精形成[10]。目前研究发现补肾健脾针刺疗法对骨质疏松症患者疗效明显[18]，针刺足三里、肾俞能抑制破骨细胞的骨吸收[19]，增加骨密度、提高骨形成、增强骨强度[13]，通过调节破骨细胞骨吸收与成骨细胞骨的动态平衡，可达到防治骨质疏松症的目的，但现有研究未阐明其具体机制。
表观遗传修饰研究的是基因序列不变，产生可遗传的基因表达改变，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、微小RNA(miRNA)等[20]。其中DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的催化下，将甲基基团可逆性转移到基因组鸟苷酸(CpG)二核苷酸上[21]，启动子序列DNA甲基化抑制基因表达[22]。间充质干细胞是成骨细胞的来源，研究表明，DNA甲基化能够调控多种成骨、破骨基因的表达，其中关键基因启动子的甲基化在间充质干细胞在向成骨细胞分化、破骨细胞的过程中起抑制作用，进而影响成骨、破骨细胞的活性与分化，影响成骨的发生发展[23-25]。与此同时，研究表明骨细胞感受机械刺激后亦能抑制间充质干细胞成骨基因甲基化，从而促进成骨细胞分化及骨形成[9]。而作为成骨细胞形成的中心环节，Runx2可调控骨钙、骨桥蛋白、骨唾液蛋白、Ⅰ型胶原等多种重要成骨细胞表型基因的表达[26-29]。现有研究表明，去卵巢造成骨组织Runx2启动子高甲基化，抑制其转录，下调其表达，从而下调多种成骨细胞表性基因的表达，导致骨质疏松症的发生[30]。目前已有研究表明，鹿茸中药复方、补肾中药复方、仙灵骨葆胶囊等具有补肾功效的中药复方能够降低绝经后骨质疏松症模型大鼠骨组织的Runx2启动子甲基化水平，上调Runx2的表达，进而促进成骨[30-31]。
目前基于中药、针灸防治骨质疏松症的临床研究与动物实验很多，但是明确针对电针肾俞、足三里与Runx2甲基化的研究仍然较少，Runx2作为影响骨质疏松症发生发展的重要因素[32-37]，电针通过影响其甲基化防治骨质疏松症的具体作用机制仍待深入研究。
此次研究结果显示，通过电针具备补肾功效的肾俞、足三里，能够升高骨质疏松症模型大鼠骨组织中骨密度，明显改善股骨最大载荷、刚度及弹性模量，升高血清骨钙、P1NP的含量，下调骨桥蛋白、骨唾液蛋白及Runx2启动子CpG1、CpG2、CpG3、CpG4.5的表达，这提示电针肾俞、足三里等穴位可通过降低骨组织Runx2启动子甲基化水平，促进其转录，进而上调其靶基因骨钙、Ⅰ型胶原等的表达，下调骨桥蛋白、骨唾液蛋白的表达，促进成骨细胞分化，增加骨形成与骨骼骨密度，改善股骨最大载荷、刚度及弹性模量等骨骼生物力学性能，有效降低或延缓骨质疏松症的发生发展。
此次研究结果中，除血清P1NP水平外，电针穴位组与雌二醇组对其余指标的改善并未见统计学差异，不能作为电针肾俞、足三里穴位能够较雌二醇更有效防治骨质疏松症的有力证据，且由于骨代谢中各类细胞分化及相关基因转录的复杂性[38]，具体机制仍需进一步研究证明。
综上所述，电针肾俞、足三里穴位可通过降低骨组织Runx2启动子甲基化水平，上调Runx2的表达，进而促进骨形成，增加骨骼骨密度，改善股骨的生物力学性能，有效治疗骨质疏松症。提示骨质疏松症的发病机制之一或为骨组织Runx2启动子甲基化水平升高;电针肾俞、足三里等穴位或通过降低骨组织Runx2启动子甲基化水平，有效防治骨质疏松症。——论文作者：陈赵1，2，莫雨晴3，唐宏宇4
