摘要生物体在正常生命过程中面临内/外因来源的DNA损伤，DNA损伤不仅影响基因正确复制，也阻碍其正常转录.为避免DNA损伤带来的灾难性后果，生物体进化出一整套修复机制，以保证复制和转录的正确性、基因组的完整性和遗传的稳定性.本文重点综述了RNA聚合酶监视(RNApolymerase-surveilled,RNAP-S)的DNA修复机制.首先从RNAP结构出发介绍了RNAP对DNA损伤的感知机制;其次讨论了滞留RNAP的回溯、与其模板DNA的解离以及后续修复机制的启动，真核细胞CSB及其泛素化和OGG1介导的RNAP-S修复;最后探讨了RNAP-S损伤修复的生物学意义并对其前景进行了展望.
关键词RNA聚合酶，DNA损伤，RNAP感知损伤，RNAP-S修复机制1
0引言
DNA是生物体遗传物质，其完整性对生命活动的正常运行有着关键的作用[1].然而，生物体基本无法避免来自外界和生物体自身内部的DNA损伤，若不及时修复这些损伤，将会对生物体产生灾难性的后果[2]：(1)DNA复制(replication)和转录(transcription)过程将不能正常进行，严重影响了基因组的完整性和稳定性[3];(2)会导致细胞的功能阻碍[1]，细胞癌变[4-6]，死亡[7];(3)也会引发生物体的各种疾病[4].
染色体复制过程中的碱基错配、水解和脱氨基作用是自发性损伤的主要来源[2].DNA损伤的外因来源较多，诱变剂能够引发烷化、氧化等作用造成突变[8];紫外线诱变形成嘧啶二聚体从而不能配对[9];γ射线、X射线会引起DNA双链的断裂[8];嵌入剂能引起碱基的插入或缺失[8].面对无法避免的DNA损伤，生物体进化出相应的DNA损伤修复系统来应对这些挑战.常见的DNA损伤修复方式有：光激活修复、错配修复、剪切修复，重组修复、跨损修复和非同源末端修复等[2,9](.1)光激活修复系统(photoreactivationrepair,PHR)修复紫外线诱变形成的嘧啶二聚体，被光激活的DNA光解酶断裂嘧啶二聚体之间的共价键而实现直接修复此类DNA损伤[8];(2)错配修复(mismatchrepair,MMR)用来修复DNA复制过程中的碱基错配[10].原核细胞MutS、MutL和MutH蛋白通过新复制DNA半甲基化特性识别错配位点并在其附近切开新链、后由UvrD解旋消化产生缺口，再以正确(旧链)链为模板，由DNA聚合酶和DNA连接酶生成新正确链，完成错配修复[2,10].真核细胞同源蛋白MSH、MLH、PMS通过类似方式完成错配修复[10];(3)剪切修复(excisionrepair,ER)包括核苷酸切除(nucleotideexcisionrepair,NER)和碱基切除修复(baseexcisionrepair,BER)两种.大肠杆菌UvrA、UvrB、UvrC和UvrD能够识别双螺旋上的扭曲，并切除含有损伤的一小段单链片段，后由DNA聚合酶和连接酶修补至正确序列而实施核苷酸切除修复[11].人细胞XPC、XPA、XPD、RPA、XPG和XPF等同源蛋白执行相同的功能[9].在碱基切除修复中，NTHL1、NEIL1或OGG1糖基化酶先切除错误碱基，随后无碱基(apurinic-apyrimidinic,AP)位点内切酶或外切核酸酶切除形成的无碱基戊糖，所形成的缺口由DNA聚合酶和连接酶修复[2].(4)同源重组修复(homologousrecombination,HR)过程可修复双链断裂(double-strandbreak,DSB)损伤，也修复DNA复制中的错误[12].原核细胞DSB修复途径被称为RecBCD途径，参与的重要蛋白有RecA、RecBCD、RecFOR、RuvAB和RuvC[12].真核细胞Rad51、Dcm1、Spo11、MRX、Rad52、Rad59、Rad51c-XRCC3、WRN和BLM完成同源重组修复[9];(5)非同源末端修复(nonhomologousendjoining,NHEJ)是姐妹染色单体形成前的一种修复方式[9].在哺乳动物中，已发现该途径的相关蛋白有Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Artemis和XRCC4等[3,9](.6)跨损DNA合成(translesionsynthesis,TLS)指细胞未能修复损伤时，复制机器绕过受损部位而无模板直接合成DNA链的修复机制，可避免染色体的不完全复制[13].原核细胞DNAPolIV(DinB)或DNAPolV[8]，真核细胞REV1、Polδ、Polε、Polκ和Polτ负责跨损合成[2].
基因转录过程本身也是独特的DNA损伤修复机制[14].本文重点综述了转录过程中RNA聚合酶(RNApolymerase,RNAP)监视下的修复机制，该机制对DNA损伤的修复有重要的作用，也有利于解决复制和转录的冲突，确保正确转录物的形成，对生物体的正常活动有着不容忽视的作用[3,14-16].
1RNAP识别DNA损伤并滞留
当转录中的DNA双链产生诱变损伤时，转录模板链(templatestrand)的修复程度要高于编码链(codingstrand)[17,18]，模板链的修复比编码链的修复更快，而编码链的修复与基因组DNA的修复节奏基本一致，可见转录中优先修复模板链的DNA损伤[19-21].RNAP沿模板DNA转录过程中，会感知DNA损伤，并招募修复蛋白，继而修复损伤DNA[22]，在此我们称之为RNAP监视(RNAP-surveilled,RNAP-S)的DNA修复(RNAP-Srepair).RNAP监视的DNA修复不仅存在于活跃转录过程，也可见于低水平转录过程[20]，而且在进化上是保守的细胞过程[1].
1.1RNAP被DNA损伤物理阻止
转录模板链上的DNA损伤，如单链断裂[23]、双链断裂[24]等会阻碍RNAP在模板链上的正常前行.此外，非正规的DNA结构如DNA发夹、RNA:DNA杂合体[25]、茎环结构[26]也会物理障碍性造成RNAP的滞留;同样，DNA结合蛋白如抑制子[27]、转录终止因子Rho蛋白结合在模板DNA上会阻滞RNAP;真核细胞核小体结构也会阻碍转录中RNAP的前行[27].的确，数学模型和定量实验发现，减少LacI路障的占用能明显增加RNAP的变位(dislodgement)[27];聚丙酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)实验结果说明RNAP也能被1,N6乙烯基腺嘌呤修饰(1,N6-ethenoadenine,εA)强烈阻碍[28];利用扫描力显微镜(scanningforcemicroscopy,SFM)和磁镊(magnetictweezers,MT)监测RNAP在含有拓扑环结构的DNA链上的行进过程，发现DNA环形拓扑结构能有效的阻碍RNAP而干扰转录[29].
1.2RNAP识别DNA损伤修饰
1.2.1三种RNAP的结构功能
多亚基蛋白复合体RNAP保守存在于细菌、古细菌、真核生物中，转录合成各类RNA，其核心酶(coreenzyme)发挥主要合成作用.最简单的细菌RNAP核心酶由β、β’、ɑ二聚体、ω亚基构成[30].古细菌核心酶与真核生物RNAPⅡ有显著的结构保守性[31].真核生物的三种RNAP核心酶结构具有同源性，其中有两个亚基较为保守，160kDa左右的Rpa1、Rpb1、Rpc1，大约150kDa的Rpa2、Rpb2、Rpc2分别是RNAPⅠ、RNAPⅡ、RNAPⅢ的2个亚基[30].此外，三种RNAP还都具有Rpb5、Rpb6、Rpb8、Rpb10、Rpb12亚基[32].但它们功能存在差别：RNAPⅠ负责合成核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)[30];RNAPⅡ与信使RNA(messengerRNA,mRNA)、多数小核内RNA(smallnuclearRNA，snRNA)、微小RNA(microRNAs)的合成有关[30];转运RNA(transferRNA,tRNA)、5SrRNA和一些其它小RNA(smallRNA)由RNAPⅢ合成[30,33](表1).
1.2.2RNAPII结构
真核生物的多亚基蛋白RNAPⅡ负责转录所有编码蛋白的基因和许多非编码RNA，也在RNAP-S修复中感知损伤[35].RNAPⅡ几个重要的结构域：(1)RNAPⅡ的突出结构特征—裂口(cleft)，是一个深的、带有正电的凹槽，包含活性位点(activesite)、壁(wall)、突出物壁(protrusion)等[36].DNA双链在解链前位于裂口的上方，当DNA双链解链后模板链进入裂口到达活性位点，核糖核苷酸(ribonucleotidetriphosphates,NTPs)从漏斗(funnel)位点处进入;形成的RNA:DNA杂合链在靠近活性位点的壁处分离，起始于壁附近的RNA出口通道引导RNA离开;位于裂口DNA出口处的突出物—壁，可能负责模板DNA链从RNAPⅡ离开的过程[36].(2)RNAPⅡ的触发环(triggerloop,TL)和桥螺旋(bridgehelix,BH)是两个重要的与DNA碱基识别、保真性相关的结构域[36,37].Rpb1亚基上的TL负责磷酸二酯键的形成，影响转录中NTPs的添加效率[37]，并保持底物特异性[35];在活性位点处添加NTPs时，其构象从开放转变为关闭从而激活活性[37];BH负责连接RNAPⅡ的两个部分，将RNAPⅡ催化位点与下游的主、次要通道分开，模板装载中越过BH的步骤可作为RNAP变位的检验点[37].(3)其它结构域例如：夹钳(clamp)、茎秆(stalk)同样是RNAPⅡ的重要结构，负责调控裂口的开放、闭合构象[36];舵(rudder)和盖(lid)是Rpb1结构域的残基，靠近活性位点，有利于将RNA引导至其出口通道，将DNA引导到壁突起处[36];Rpb1的C-末端结构域(C-terminaldomain,CTD)是调控RNAPⅡ转录的中心[38].
1.2.3RNAPII识别DNA损伤修饰并滞留
RNAPⅡ能识别UV诱导下产生的链内交联损伤[39]、具有轻度螺旋扭曲特性的环丁烷丙胺二丁二聚酯(cyclobutenepyrimidinedimers,CPD)、具有强螺旋扭曲特性的6-4光产物(pyrimidine-pyrimidonephotoproduct,6-4PP)[40,41]、脱氧尿苷、8-氧腺嘌呤(8-oxyadenine,8oA)、8-氧鸟嘌呤(8-oxoguanine,8oG)[23]、胸苷二醇(thymidineglycol,TG)[31]、烷基化损伤[42,43]、无碱基损伤[44]、烟草相关诱变剂产生的鸟嘌呤加合物[4]的损伤、双链断裂[5,24,25,45]以及DNA发夹、RNA:DNA杂合体等非正规的DNA结构[25].
RNAPⅡ在感知DNA损伤时，不与受损的碱基直接发生作用，而是感知其转录发生障碍后引起的空间位阻(sterichindrance)[46].装载DNA模板时，DNA下游模板需要越过桥螺旋(BH)，才能到达活性位点添加NTPs以进行正常转录，此跨越步骤(crossing-overstep)需要模板发生显著的构象变化[37,46].但存在大规模DNA损伤的DNA链往往由于受损的碱基与RNAPⅡ的桥螺旋结构上方相结合而不能发生正常的构象变化[35,37,47]，RNAPⅡ无法正常装载DNA模板链，变位步骤受到阻碍因此发生滞留现象[46].CPD，AP部位和5-胍海因(5-guanidinohydantoin,Gh)这几种损伤引起的DNA损伤构象也都能较为稳定的结合于桥螺旋的上方部位，这是RNAPⅡ的Rpb1亚基中的Arg337与损伤的DNA链磷酸基团相互作用的结果，而在正常转录过程中，该状态是短暂存在的[46].DNA碱基胞嘧啶甲基化修饰的中间物5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)也与RNAPⅡ的桥螺旋结构上方结合，Rpb2亚基通过Q513残基，特异性识别5caC，并最终诱导转录的停止[35,37](图1).
当遇到较小的损伤如CPD、AP、Gh时，RNAPⅡ虽然受到阻碍，但不足以被滞留[37,46,47].在这种状态下，RNAPⅡ缓慢的经过损伤位点，并发生不依赖于模板的AMP优先的碱基错误掺入，导致转录产物mRNA中相对损伤的位点的突变，这种易错的修复方式(error-pronetranscriptionalbypass)被称作A规则(A-rule)[37](图1).形成的含有错误碱基的RNA:DNA杂合链在穿过杂合链通道(hybridbindingchannel)时也会受到严重的阻碍，不过在8oA损伤研究中发现这种延伸受阻现象仅出现于损伤后的3nt内，当移动足够远时，杂合链的任何变形都可以被容忍，以便RNAPⅡ发挥更快的催化作用[31].这种以掺入错误碱基选择绕过损伤的方式也与触发环结构域闭合状态相关[46].在原核生物中，也存在易错修复方式[48,49].此外，不同生物的RNAP应对不同的损伤[31].与噬菌体、细菌、真核生物的RNAP相比，古细菌的RNAP具有更高的敏感度，能识别并滞留在多种损伤处[31](表2).
2RNAP监视的DNA损伤修复机制
在RNAP监视的DNA损伤修复过程中，滞留的RNAP信号会被转录偶联修复因子识别，RNAP可以从模板链解离(dissociated)[50]、回溯变位(backtracked)[51]、降解(degraded)[52]，并引发后续修复蛋白的组装和修复.
2.1滞留RNAP解离和修复启动
细菌中mfd基因的缺失会导致基因突变率下降[53,54]，其编码的转录偶联修复因子Mfd(mutationfrequencydecline)介导RNAP-S-NER过程[55].Mfd识别并结合转录模板链上滞留的RNAP，利用其转位酶活性，使RNAP从DNA模板链上解离下来，并招募NER修复因子、DNAPolI、DNA连接酶完成DNA的损伤修复[56](图2).Mfd具有D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7等多个结构域.N-末端的D1a、D2、D1b组成UvrB的同源组件(UvrBhomologymodule,BHM)，可与UvrA相互作用;D4能与RNAP的β亚基相互作用;D5、D6是马达结构域，驱动Mfd在DNA上的变位[55];D7与N-末端相互作用，使蛋白处于无活性构象，只有与RNAP相互作用，Mfd才能稳定结合于DNA链，发挥移位酶的活性[56,57].
“Mfd释放追赶”模型(releaseandcatch-upmodel)说Mfd可以独自在裸露的DNA链上移位以搜索滞留的转录延伸复合物[58]，的确有体内实验证明Mfd可单独结合于双链DNA[57].Mfd在DNA链上通过转位酶结构域的TD1、TD2交替步向前移位，但运动速度慢、持续时间短，如果遇到滞留的RNAP，Mfd会与RNAP发生相互作用，并更稳定的与DNA结合[58].单分子实验验证了Mfd与RNAP的结合，并说明细胞中通常处于“关闭状态”—无活性构象的Mfd，遇到滞留在模板链上的RNAP便通过其D4结构域与RNAP的β亚基相互作用，引起D2-D7抑制型构象发生变化，并激活其转位酶活性[57].借助ATP水解提供的能量，Mfd取代RNAP使其从DNA模板解离，从而暴露出模板链上的损伤部位[55]，同时Mfd也露出BHM结构域，并招募结合UvrA[11].细胞内单分子研究验证UvrA远端的ATP酶位点催化ATP水解，使UvrA二聚体与Mfd结合，并导致移位停止，同时招募UvrB，形成Mfd-2UvrA-UvrB复合物，随后UvrA近端ATP酶催化ATP水解，使UvrB通过β发夹与DNA结合，并最终导致2UvrA与Mfd同时解离[11,56].后续招募的UvrD和UvrC分别发挥移除损伤单核苷酸链和切除DNA的作用，其形成的缺口由DNA聚合酶和DNA连接酶修复完全[55].值得一提的是，Mfd可以解离模板链上较强损伤处的RNAP，也能促进较弱损伤处RNAP的变位而跨越损伤[58].事实上，Mfd可与非NER因子共同作用，以一种易错的方式修复DNA损伤[48,49].当DNA复制叉与转录中的RNAP发生碰撞时，Mfd可通过促进RNAP的变位，促使碰撞后的复制叉直接重启[16]，但在低核苷酸浓度下，RNAP大多选择滞留，此时Mfd会增强转录终止[58].
DksA，以Mfd类似方式，也会解离滞留在DNA损伤处的RNAP，进而修复DNA模板上的损伤[59].DksA由151氨基酸组成的转录因子,具有5条α螺旋，分成3个结构域[60].分别是球形结构域(Gdomain)、卷曲螺旋结构域(CCdomain)、C-末端结构域(C-terminaldomain)[61].DksA通过CC结构域进入RNAP的次级通道与RNAP相互作用，但并不与活跃的转录复合物结合[62].DksA单独与RNAP的相互作用使得RNAP的DNA结合主通道βlobe/i4结构域发生变化，从而破坏RNAP的稳定性[59].不过，体外研究表明DksA并不影响RNAP稳定性[59].DksA单独与RNAP的结合会降低RNAP-DNA稳定性，有助于移除RNAP而暴露损伤的DNA片段，但此过程并不破坏RNA:DNA杂合体，RNA还可为DNA合成作引物[59,63].
不同诱导剂引发的DNA双链断裂损伤中，DksA的应答存在差异[59,62].对腐草霉素(Phleomycin)诱导所产生DNA的DSB损伤，DksA以一种被动作用的方式参与RNAP-S修复[62].DksA和GreA同为RNAP次级通道的结合因子.与ppGpp协同[19]，DksA可通过与反回溯因子GreA竞争性结合RNAP次级通道而增强UvrD的回溯作用[62].对萘啶酸(nalidixicacid,Nal)诱导产生的带有拓扑异构酶复合物的DSB损伤来说DksA是必须的[59].此时DksA不依赖于ppGpp，而是直接促进RNAP的移除但并不发生RNA的解离[59].——论文作者：王菲尔**，杨绎煊**，莫日根**
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