【摘要】目的探讨早孕期绒毛活检及细胞遗传学分析在产前诊断中的应用。方法回顾性分析2002年4月至2019年9月在北京协和医院产前诊断中心进行早孕期绒毛活检及细胞遗传学检测的1702例患者的临床资料，统计培养成功率及染色体异常率，并对其诊断指征进行分析。结果1702例绒毛组织标本中，培养成功1602例，成功率为94.12%。穿刺的临床指征中以高龄妊娠(43.60%)和单基因病史(29.14%)为多见。检出染色体核型异常共161例，异常率10.05%，其中纯合型异常核型有153例，嵌合型异常核型有8例，包括21-三体53例、18-三体39例、13-三体10例、性染色体异常31例、其他常染色体数目异常9例、染色体结构异常17例、多倍体2例。染色体异常发生率最高的是夫妻染色体异常组，染色体异常率39.13%(9/23);其次是早孕期超声异常组，染色体异常率35.14%(110/313);单基因病产前诊断的464例样本中，检出6例染色体异常。1702例绒毛样本中取材后胎儿丢失5例，流产率0.29%。结论早孕期绒毛活检及核型分析能够有效提前产前诊断时间，尤其适用于单基因病孕史及早孕期超声异常的产前诊断。绒毛组织培养可以获得较高的培养成功率，失败原因多见于样本量少及细胞活性欠佳。绒毛染色体嵌合时要警惕胎儿与胎盘染色体不一致的情况。
【关键词】绒毛活检;核型分析;染色体病
绒毛取样活检术(Chorionicvillussampling，CVS)是一种早孕期(11～13+6周)介入性产前诊断技术，有助于早期诊断和早期处理，是预防出生缺陷的重要手段[1]。染色体核型分析可以有效检出染色体数目异常，以及大片段的缺失、重复、易位、倒位等结构异常，是细胞遗传学产前诊断的金标准[2]。本文回顾性分析了北京协和医院1702例早孕期绒毛细胞培养及染色体核型分析结果，对产前诊断指征和异常结果之间的关系进行讨论，并对绒毛取样活检术在产前诊断中的应用进行总结。
资料与方法
一、研究对象
选取2002年4月至2019年9月在北京协和医院产前诊断中心行超声引导下绒毛活检术的早孕期患者。
纳入标准：(1)孕11～13+6周;(2)资料完整;(3)产前诊断指征包括高龄妊娠、单基因病孕史、超声异常(胎儿颈部透明层增厚、颈部水囊瘤、鼻骨缺失、全前脑，巨膀胱等)、夫妻双方之一有易位或倒位等染色体异常、孕产史不良(不明原因流产、胎停育、畸形儿孕产史、21-三体等染色体病孕产史等)。
排除标准：孕妇存在出血、感染等产前诊断禁忌症。
本研究共纳入1702例患者，根据产前诊断指征进行分组，当高龄合并其他指征时，以其他指征为分组标准。
二、方法
1.样本采集：受检者在孕11～13+6周时，在超声引导下，经腹部穿刺，吸取绒毛样本15～20mg，挑选合格组织样本转移送达实验室。
2.样本处理及组织培养：在超净工作台中将样本清洗后移至15ml无菌离心管中，加入胰酶溶液和胶原酶溶液，置于37℃水浴，2000r/min离心，弃上清，加入6ml羊水培养基(CHANG，美国)，吹打混匀后，接种至两个细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中静置培养5～7d换液，继续培养24～48h后，于倒置显微镜下观察克隆状态以备收获。
3.收获及显带：培养瓶中加入秋水仙素(上海沃凯)工作液，置于37℃水浴箱中作用15min。将培养基-细胞混合液倒入15ml离心管，在原培养瓶中加入0.25%胰酶-EDTA溶液(Gibco，美国)，置于37℃水浴箱中静置15min后，轻摇培养瓶，收集细胞，2000r/min离心10min，弃上清，经低渗、固定处理后在适宜的温湿度(温度25℃、湿度50%左右)条件下进行滴片。80℃恒温干燥箱中3h。胰酶吉姆萨分带染色。
4.分析使用Cytovision分析系统(徕卡，德国)扫描并采集图像，计数两个独立培养瓶中至少20个细胞，分析5个细胞，核型配对2个细胞[3]。依照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)进行分析。
三、统计学分析
应用SPSS22.0软件进行数据分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、一般情况
本研究共纳入1702例早孕期患者，年龄18～50岁，孕周11～13+6周。将染色体核型分析成功的病例按照临床指征进行分类统计(表1)。
二、绒毛细胞培养结果
绒毛细胞培养成功并获得诊断级别及数量的共1602例样本，成功率94.12%，100例因细菌污染(35例)，核型数量不足、带型欠佳(65例)等原因未得出诊断结果。后续均通过羊膜腔穿刺获得产前诊断。
三、异常结果检出情况
1602例有诊断结果的样本中检出异常染色体核型161例，异常率为10.05%(161/1602)，其中21-三体53例、18-三体39例、13-三体10例、性染色体异常31例、其他常染色体数目异常9例、染色体结构异常17例、多倍体2例。
相关期刊推荐：《生殖医学杂志》(月刊)1992年创刊，本刊为适应我国计划生育事业发展的需要,受国家计划生育委员会的委托,由北京协和医院与国家计划生育委员会科学技术研究所联合主办,并经国家科委批准,国内外公开发行的国家级学术性刊物。设有：论著、评论、综述、临床经验、技术交流、研究简讯、讲座、会议消息等栏目。
因单基因病进行产前诊断的464例样本中，检出6例异常结果，异常率为1.29%。
超声异常组中异常率35.14%(110/313)，包括胎儿颈部透明层(nuchaltranslucency，NT)增厚261例、颈部水囊瘤23例、鼻骨缺失、全前脑或巨膀胱等其他指征29例。将261例涉及NT增厚的病例分为两组，单纯NT增厚192例，检出异常核型39例;NT增厚合并其他超声异常或软指标69例，检出异常核型43例，组间差异有统计学意义(c2=41.57，P<0.05)。另外17例染色体结构异常包括7例平衡易位、4例倒位，其余6例在染色体断裂和(或)重接过程中出现了遗传物质的丢失或重复。产前诊断指征与染色体核型分析异常结果见表2。
四、嵌合发生结果
161例异常病例中，纯合型异常核型153例，嵌合型异常核型8例，具体分为1例[47，XY，+7/46，XY]、1例[47，XY，+15/46，XY]、1例[47，XY，+21/46，XY]、1例[69，XXY/46，XY]、1例[45，X/46，XY]、3例[45，X/46，XX]，嵌合发生率为0.50%(8/1602)。8例嵌合病例均进行了羊膜腔穿刺并进行羊水细胞染色体核型分析，除7号染色体嵌合在羊水中未出现外，其余7例均与绒毛结果相符。
五、穿刺后流产情况
1702例样本中，穿刺后2周内胎儿出现停育的病例共计5例，流产率为0.29%。
讨 论
一、早孕期CVS指征及与异常结果的关系
目前我国介入性产前诊断方式以中孕期羊膜腔穿刺为主，而早孕期CVS可以在孕11～13+6周获得胎儿样本进行产前检测，提前了产前诊断时间，异常结果终止妊娠相对安全[4]。CVS的指征与中孕期羊膜腔穿刺有所不同。我院中孕期羊膜腔穿刺的指征前三位为高龄妊娠、唐氏筛查或无创产前检测高风险、孕产史不良，而CVS的指征前三位分别为高龄妊娠、单基因病孕史及早孕期超声异常。
由于我国开展早孕期一站式唐氏综合征筛查的机构较少，中孕期唐氏筛查高危的孕妇只能进行中孕期产前诊断。无创产前检测于孕12周开始采血，获得结果往往已超过CVS孕周，加之绒毛滋养细胞染色体可能与胎儿不一致[5]，因此无创产前检测高风险孕妇往往也只能接受中孕期产前诊断[6]。高龄孕妇则可以根据自己的意愿，在早孕超声正常的情况下，自主选择CVS或羊膜腔穿刺。
在我院CVS的指征中，单基因病孕史占到29.14%。我国单基因病诊断水平近年来提高迅速，单基因病先证者家庭再次妊娠时寻求尽可能早期进行产前诊断。在本研究单基因病进行产前诊断的464例样本中，除一例合并高龄外，其余均<35岁。经产前遗传咨询后，孕妇均要求平行检测单基因病和染色体病，检出6例染色体核型异常结果(异常率1.29%)，并且染色体异常形式多样。使用MLPA和/或测序技术可以检测出单基因病突变位点，但通过针对目标基因的MLPA或测序无法进行核型诊断。因此，对于此类病人，除了对目标单基因病外，可以在检测前咨询时说明染色体核型分析的必要性，建议同时排除常见染色体疾病[7]。
早孕期超声异常或软指标异常是我院CVS的第三顺位指征。早孕期超声在我国已得到广泛开展，超声异常可能提示胎儿染色体异常，胎儿染色体核型异常发生率也随着软指标数量的增多而上升。本研究中超声异常组染色体总异常率高达35.14%(110/313)，临床指征中83.39%(261/313)为NT增厚。在NT增厚的261例病例中，69例合并其他软指标异常，染色体异常检出率为62.31%(43/69)，高于单纯NT增厚的病例(39/192，20.31%)。因此对于NT增厚的病例，尤其是合并高龄妊娠或其他软指标异常时，建议早孕期CVS检测[8]。另据文献报道，颈部水囊瘤是性染色体异常的常见表现形式[9]。本次分析中23例颈部水囊瘤病例中检出15例染色体异常，其中9例为性染色体异常，均为45，X，与文献报告符合。
在CVS指征中，夫妻双方之一染色体平衡易位携带虽然仅占1.53%，但绒毛染色体异常比例最高(9/23，39.13%)。夫妻双方之一的染色体异常均为染色体平衡易位，包括罗伯逊易位。染色体平衡易位在新生儿的发生率为1/500～1/650[10]，其中罗伯逊易位在一般人群中的发生率为1/900～1/1000，子代获得的几率较高，及时发现并诊断，对胎儿出生后成长发育及婚育有指导作用。绒毛染色体核型分析能够发现5～10M以上的缺失或重复，而染色体易位造成的微缺失、微重复需要进行全基因组芯片检测或测序方能获得诊断[11]。随着分子检测技术的发展，夫妻双方之一染色体平衡易位的患者应建议CVS时进行染色体微阵列分析[12]。
二、CVS取材与绒毛培养
由于CVS取材操作及组织培养的难度远远高于羊膜腔穿刺及羊水细胞培养，存在胎盘嵌合、母体污染、组织培养生长缓慢等问题，在我国未能得到广泛使用。我院自2003年开始进行绒毛培养及细胞遗传学分析，已形成相对成熟的操作流程及质量控制体系，可以获得较高的培养成功率[13]。
本研究中绒毛组织培养成功率为94.12%，100例培养失败的病例中，35例为被污染的病例，多发生在实验室开展绒毛培养的初期。可能原因：(1)不能除外孕妇存在宫内感染，尽管穿刺前病史采集、测量体温、血常规检测可能有助于识别感染，但不能完全排除感染;(2)接种及培养环节的操作问题，绒毛接种前增加了消化细胞环节，处理过程中更需要注意无菌操作。65例核型少的病例多发生于单基因病组，考虑原因可能与样本取材量相关。因样本需要同时做基因及染色体分析2项检测，对标本量需求相对大，此外绒毛取材样本量还与孕周、胎盘位置、穿刺部位以及操作者的熟练程度有关。
我院CVS相关流产率为0.29%，与国内外文献报告的数字接近[14]。
三、绒毛样本细胞遗传学分析中的特殊问题
绒毛染色体出现嵌合时，既可能同时存在胎儿染色体异常，也可能与胎儿不一致。这与绒毛组织的发育来源有关。CVS所获得的样本为早孕期胎盘绒毛，主要为细胞滋养细胞及绒毛间质，并非真正的胎儿组织[15]。绒毛表面和绒毛间质来源于不同的细胞群，前者由滋养层细胞发育而来，后者则由内细胞团分化后的胚外中胚层进一步发育而来。由于来源不同，可能出现绒毛核型与胎儿不符的情况，出现的嵌合现象称为限制性胎盘嵌合(confinedplacentamosaicism，CPM)。按照所累及的绒毛细胞，CPM可以分为3种类型：Ⅰ型CPM，异常的染色体只存在于细胞滋养层细胞中，仅可以在短期培养后见到;Ⅱ型CPM，异常的染色体局限存在于绒毛的间质核心层细胞中，需要经过长期培养后才能见到;Ⅲ型CPM，异常的染色体既存在于细胞滋养层细胞中，也存在于间质核心层细胞中，在短期培养后和长期培养后均可见到[16]。文献报道中，CVS检查发现2、3、5、7、10、11、14、16、17-三体嵌合时，胎儿核型往往并无异常[17]。
绒毛嵌合体的另一种可能是胎儿真性嵌合体，即胎儿本身存在两种或以上的细胞系[18-19]。本研究中8例嵌合病例均进行了羊膜腔穿刺及染色体核型分析，除7号染色体嵌合在羊水中未出现外，其余7例均与绒毛结果相符。
另外，母体细胞污染(Maternalcellcontamination，MCC)也是造成嵌合体出现的原因，胎盘结构中羊膜和叶状绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，蜕膜构成胎盘的母体部分，取材时应尽量躲避蜕膜部位，改善进针角度和部位，并在处理绒毛组织之前尽可能剔除蜕膜以避免干扰结果。本研究中嵌合体检出率低于文献报道的1%～2%[20]，可能与穿刺指征构成有关。
四、总结
近年来，CVS已经是早孕期介入性产前诊断的常用方法，我院在孕11～13+6周超声引导下经腹绒毛取材具有较高的成功率，极低的穿刺流产率(2～3/1000)。绒毛染色体核型制备方法成熟，分析原则有严格的质量控制。现阶段的产前诊断工作中细胞遗传学仍为主流检测方法，可以发现染色体数目和结构异常，对当次妊娠诊断及后续生育指导有显著临床意义。CVS尤其适用于单基因病孕史及早孕期超声异常的产前诊断，当绒毛染色体出现嵌合时，要警惕胎儿与胎盘染色体不一致的情况。——论文作者：郝娜，田晓彤，周京，戚庆炜，蒋宇林，周希亚*，刘俊涛
