摘要：光滑念珠菌逐渐发展成为禽念珠菌属第二大致病菌，该菌通常是口腔、食道、胃肠道的正常菌群，当机体免疫力下降时即表现出对宿主的致病性，菌株一旦进入血液便会扩散到全身，造成系统性念珠菌病。光滑念珠菌主要感染鸡和鸽，临床中以禽食欲减退、消瘦、发育迟缓、羽毛松散和精神沉郁为主要症状，剖检可见嗉囔黏膜表面形成白色假膜或白色圆形隆起溃疡，形似地毯状病变，俗称念珠菌症。光滑念珠菌侵染过程中以酵母形态存在，未见其菌丝形态，入侵时通过形成生物膜来逃避医学灭菌、消毒作用，利用黏附素家族形成的黏附素吸附入侵宿主，依靠水解蛋白酶等相关毒力因子破坏宿主细胞，从而表现出致病性。动物机体以巨噬细胞吞噬及氧化应激反应来抵抗光滑念珠菌的侵染，该菌则通过过氧化氢酶和超氧化物歧化酶两种解毒酶的表达及抗氧化剂谷胱甘肽和硫氧还蛋白的产生来解毒活性氧化物，从而在机体免疫攻击中幸存。为了应对光滑念珠菌感染造成的经济损失，长时间大规模的使用抗真菌药物导致光滑念珠菌耐药性不断增强，对一线抗真菌药物尤其是唑类药表现出高耐药性。研究者逐渐倾向于利用天然物质提取物来解决光滑念珠菌耐药性问题。现从光滑念珠菌病原学、毒力因子及致病性、流行病学、抗菌药物、检测技术等方面进行综述，以期为研制有效抗菌药物防治念珠菌病提供理论依据。
关键词：光滑念珠菌;病原学;毒力因子及致病性;流行病学;抗菌药物
念珠菌病(candidiasis)是由念珠菌属病原真菌引起的一种降低畜禽采食量、抑制畜禽生长并在嗉囔黏膜出现明显增厚、被覆假膜或溃疡为主要病症的疾病[1]。念珠菌广泛存在于禽类的消化道中，鸡、鸽感染性强，其次为鸭、鹅[2]，俗称鹅口疮。临床中常见菌种为白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、热带念珠菌[3]。本研究就禽光滑念珠菌现有研究情况进行综述，以期为研究者提供更准确系统的参考。
1病原形态特征
光滑念珠菌有性期隶属于子囊菌门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科，无性阶段隶属于半知菌门、芽孢纲、隐球酵母目、隐球酵母科、念珠菌属。在沙保罗培养基中37℃培养24～48h，可形成具有酵母样气味、乳白色、凸起、湿润、表面光滑、边缘整齐的菌落，在科马嘉显色培养基(CHROMagar)中产生较大、白色、周边稍有淡紫色的菌落，TTC-沙氏培养基中菌落呈深红色;孢子呈球形或卵圆形，直径2～4μm，革兰氏染色阳性，着色不均匀[4-5]。念珠菌属包含150多个种，临床中最常见的主要有白色念珠菌和光滑念珠菌，然而在系统发育上，光滑念珠菌与非致病性酵母的亲缘关系比与其他致病性念珠菌的亲缘关系更近[6]。光滑念珠菌是一种单倍体发芽酵母，只能以酵母形式生长，30%念珠菌病由其引起，是唯一不在血清中形成芽管、致病过程中不形成菌丝[7]、1%-吐温80-玉米琼脂培养基中不形成厚膜孢子的念珠菌[8]。
2毒力因子及致病性
为了更好地在宿主体内定植，光滑念珠菌会表达多种毒力因子，如酵母与菌丝的形态转变、黏附素表达、水解蛋白酶合成、生物膜形成和对氧化应激的反应。
2.1酵母菌丝二形态特性
白色念珠菌在致病过程中会出现酵母到菌丝形态的转变，且在不同的致病部位，菌丝的形态亦有差异，然而光滑念珠菌在致病性过程中并未发现其酵母与菌丝的二形态转变，更多的是以酵母的形式存在，2000年，Csank等[9]首次报道了在固体氮饥饿培养基上光滑念珠菌发生了形态变化，并以假菌丝的形式生长;2016年，Sasani等[10]发现高CO2压力(10%)下培养72h可刺激和诱导光滑念珠菌假菌丝的形成;光滑念珠菌与巨噬细胞共同培养6个月，能产生假菌丝结构，并进化成超强毒力表型，其特征是造成巨噬细胞更高程度的损伤，逃逸速度更快[11]。
2.2黏附素表达
黏附素是光滑念珠菌的重要毒力因子，研究表明，该真菌不仅可黏附在宿主细胞(上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞)上，而且还能附着在其他微生物和非生物表面，并通过形成生物膜来逃避灭菌作用。黏附素Epa1、Epa6和Epa7与细胞毒性受体NCR1之间的相互作用是清除体内光滑念珠菌的关键[12]。在光滑念珠菌中，黏附素基因Epa1编码与上皮细胞相互作用至关重要的黏附素，调节亚基Gal11A在转录因子Pdr1调控的黏附素基因Epa1表达和与上皮细胞的黏附中起关键作用，这可能是治疗高黏附性光滑念珠菌感染的一个新的治疗靶点[13]。上皮黏附素家族的黏附素是光滑念珠菌的主要黏附素，本质是通过范德华力介导的细胞表面吸水性促进与宿主上皮细胞和巨噬细胞的黏附[14]。巨噬细胞通过细胞表面模式识别受体在清除真菌病原体方面起着至关重要的作用，光滑念珠菌更易被巨噬细胞吞噬，在巨噬细胞中持续生长，大量繁殖，最终由于真菌负载而导致细胞溶解，并被吞噬到新形成的称为吞噬小体的细胞器中，吞噬小体通过蛋白质和溶酶体的募集而成熟。光滑念珠菌具有解毒氧自由基和破坏正常吞噬小体成熟的能力，从而抑制吞噬小体的形成和吞噬小体的酸化，研究发现，C型凝集素受体Dectin-2缺乏影响了光滑念珠菌在巨噬细胞介导的吞噬作用的某些阶段，但不是所有阶段，因为Dectin-2需要与Fcrγ链偶联才能传递信号[15]。病原真菌中，细胞壁既提供了对宿主组织的入侵至关重要的黏附性，也提供了对宿主防御机制的保护，细胞壁尤其是细胞壁蛋白对真菌的生长、毒力和致病性至关重要，并在介导宿主与真菌的相互作用中起着重要作用;同时，真菌细胞壁是抗原的重要来源，已成为抗真菌药物开发的靶点，目前已开发了几种基于细胞壁成分的疫苗来对抗念珠菌病，包括蛋白靶向疫苗和糖结合疫苗[16]。
2.3水解蛋白酶相关毒力因子
蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶和溶血素等水解酶是光滑念珠菌重要的毒力因子。蛋白酶负责蛋白质的降解，导致组织浸润，天冬氨酸蛋白酶是光滑念珠菌在巨噬细胞中存活、细胞壁维持、重塑及细胞与细胞间相互作用的重要毒力因子，光滑念珠菌基因组中包含11个非分泌型天冬氨酸蛋白酶基因[17]。磷脂酶可促进细胞膜磷脂的破坏，导致细胞损伤和溶解，包括可降解宿主屏障和入侵周围组织的酶，以及参与寡肽和铁转移的蛋白，磷脂酶可将磷脂水解成脂肪酸。光滑念珠菌分泌的所有种类的磷脂酶都会对宿主细胞膜产生损害，这也可能使受体暴露以促进黏附。CgVps15和CgVps34分别是Ⅲ类3-激酶磷脂酰肌醇的调节和催化亚基，其磷酸化磷脂酰肌醇的第3羟基产生3-磷酸磷脂酰肌醇，可调节光滑念珠菌致病的几个方面，包括囊泡运输、自噬、膜动力学、宿主细胞黏附和分化、细胞内存活和全身感染中的毒力[18]。多药耐药转运蛋白CgTpo1_1和CgTpo1_2在光滑念珠菌毒力中起作用，CgTPO1_1或CgTPO1_2基因缺失均可提高光滑念珠菌的存活率，在生物膜形成过程中CgTPO1_2表达上调，它的缺失会导致黏附素编码基因在生物膜形成过程中表达降低，CgTPO1_2的表达降低了质膜电位，影响了麦角甾醇和脂肪酸的含量[19]。
2.4生物膜系统
生物膜是一种稳定的、由微生物细胞、胞外聚合物和其他非生物物质组成的复杂混合物的微生态系统，是念珠菌毒力的主要因素之一，具有适应各种不同生境的能力[20]，其特征是细胞不可逆地附着在表面并嵌入细胞外聚合物产生的基质中，这种独特的环境有利于为微生物病原体提供免受宿主免疫防御的保护，抵抗物理和化学压力，增加养分可用性，加强复杂的群落互动及新陈代谢合作[21]。光滑念珠菌生物膜较薄，厚度为75～90μm，是正常白色念珠菌生物膜厚度的一半，仅由酵母细胞组成，细胞密度较高，紧密堆积在一起，可产生大量蛋白质、碳水化合物及少量细胞外基质和胞外DNA，生物膜形成末期的生物量极少，但耐药性更强[22]。现阶段已有小鼠、果蝇模型探究光滑念珠菌生物模型形成特性，未来的研究需结合生物膜形成的体外模型和动物模型、组学方法和正向或反向遗传学，以扩大对光滑念珠菌生物膜形成的现有知识，并揭示其抗真菌耐受性的机制。
2.5氧化应激反应
光滑念珠菌的另一个重要毒力因素是对氧化应激的反应，并表现出对氧化应激更高的耐受性，在感染过程中，这些酵母必须应对宿主吞噬细胞在吞噬爆发期间产生的活性氧物种，在这种毒力因子的表达中，细胞壁是基础，病原体通过解毒酶(过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)的表达及抗氧化剂谷胱甘肽和硫氧还蛋白的产生来解毒这些活性氧物种，从而在免疫攻击中幸存[17]。尽管如此，研究者推测氧化应激反应在杀死光滑念珠菌方面起着很小的作用，因为试验中抑制巨噬细胞中氧化应激反应的产生并没有导致真菌存活率的增加[23]。在光滑念珠菌中有两种氧化应激反应途径，一种是由谷胱甘肽Grx1-5、谷胱甘肽还原酶Glr1组成的非冗余谷胱甘肽(GSH)途径;一种是由硫氧还蛋白Trx1-3、硫氧还蛋白还原酶Trr1/2、过氧化物氧化还蛋白Tsa1/2、硫醇基过氧化物酶GPX1-3组成的硫氧还蛋白(TRX)途径，这些硫醇过氧化物酶需GSH或TRX提供的还原力来中和过氧化物，保护机体免受氧化损伤。光滑念珠菌中过氧化物氧还蛋白(PRX)是以硫醇为基础的过氧化物酶。PRX在低水平的H2O2、有机过氧化物和过氧亚硝酸盐存在的情况下具有抗氧化活性，其特点是催化速率快，对过氧化物的反应性高[24]。
2.6致病性特征
光滑念珠菌是一种异常耐受的生物，能在免疫系统细胞内生存和复制。易感染1～2周龄雏禽，主要症状在消化道，尤其是嗉囔，肝脏、肺脏偶尔可见症状，一般呈慢性病程，临床无特殊症状，仅表现为食欲不佳、发育迟缓、精神不振。眼观可见嗉囔黏膜形成黄白色假膜，黏膜表面覆盖假膜性斑块及易于刮落的坏死物，嗉囔或食道肿胀，黏膜上皮复层扁平细胞全层呈现增生及肥厚，尤其是角质层过度角质化，此处可分离到光滑念珠菌病原菌，临床中急性病者无症状时就快速死亡。发生此病的家禽易产生维生素B缺乏，可能是阻碍宿主细胞吸收所致。病禽排出的粪便如果对饲料和饮水造成污染，就会经消化道引起群体性感染，也可通过卵壳造成种蛋感染[21，25]。
3流行情况
念珠菌病是由念珠菌感染引起的一种疾病，长时间使用广谱抗生素导致光滑念珠菌引起的侵袭性真菌感染发病率呈上升趋势，已发展成为念珠菌属第二大致病菌[26]。除人类外，光滑念珠菌是许多种宠物鸟，如鹦鹉、相思鸟或候鸟的常见共生菌，当机体免疫力下降时就会转变为致病菌种，越来越多的研究表明，鸟类作为一种运输者，促进了许多病原体的传播，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，鸟类通过在广阔的海洋和陆地环境中释放粪便来促进酵母菌的传播，人类可能通过接触环境中的鸟类排泄物直接感染光滑念珠菌，或通过摄入被鸟类排泄物污染的食物间接感染。人类和鸟类分离株的遗传同源性也清楚地表明，海鸥在从人类环境中获得的光滑念珠菌的扩散中发挥了作用[27]。家禽和野生鸟类是潜在致病酵母菌的储存库，它们可以很容易地通过粪便在环境中传播酵母菌，这些在泄殖腔、粪便、鸡蛋中分离到的主要是念珠菌属、毛孢子菌属、隐球菌属、红酵母属[28]。
光滑念珠菌可通过口腔、食道、胃肠道、生殖道感染，并会随着血液传播到易感宿主的内脏造成全身感染，引发系统性念珠菌病，从而对血液、心脏、大脑、骨骼和身体的其他部位造成影响，在牛、犊牛和绵羊长期服用抗生素和皮质类固醇后，可能会发生系统性念珠菌病[29]。因此，光滑念珠菌必须发展出一种策略来抵消或绕过宿主的防御系统，从而使这种真菌能引起全身性疾病。研究发现，光滑念珠菌有一个显著特征，其能在小鼠体内持续较长时间的系统感染，但不会杀死动物，也不会引起强烈的炎症反应。事实上，即使是免疫能力强的小鼠也不能在几周内清除光滑念珠菌感染，这表明免疫逃避是光滑念珠菌致病性的一个重要方面[30]。
4抗真菌药物
临床中抗真菌药物的使用增强了光滑念珠菌对唑类、棘球菌素类、烯丙胺类、多烯类等抗真菌药物的耐药性，尤其是对唑类抗真菌药物表现出较高的抗药性[31]。光滑念珠菌的老化使其具有更强的毒性，从而表现出对氟康唑更强的耐药性，在抗真菌治疗过程中了解慢性感染期间真菌种群的变化，可以有效缓解真菌耐药性问题[32]。光滑念珠菌如何迅速获得对多种药物的耐药性尚不清楚，DNA修复缺陷可能是导致耐药性的各种基因变化加速出现的原因[33]。新的抗真菌药物研究至关重要，新型棘球蚴素CD101、新型1，2，4-三唑吲哚、呋喃类二萜化合物多铝酸1等表现出对光滑念珠菌较强的抗菌活性[34-36]。明胶纳米粒、壳聚糖可将两性霉素B转运至病原体栖息的巨噬细胞，从而解决药物对细胞间真菌渗透性差的问题[37-38]。预先接种低毒力的光滑念珠菌也可起到保护作用，且这种保护是长期的，但不适应特异性免疫[39]。
随着新型药物的研发，天然抗菌药表现出良好的抗菌活性。蝎毒中大量活性肽物质表现出良好的抑菌效果[40-41]，茶树叶中提取的儿茶素[42]、响尾蛇毒液中提取的一种高度碱性肽[43]、附生马兜铃草中的原花青素聚合单宁[44]、氧钒水杨烯氨基酸配合物[45]、两栖林蛙脂肪组织获得的牛蛙油[46]、黄连叶精油[47]、姜黄素[48]等均具有良好的抗菌、消炎作用。研究发现，有机蜂胶具有很强的抗炎作用，对光滑念珠菌及其生物膜培养均显示出抗真菌活性，其作用机制是通过减少核因子-κB(NF-κB)的活化、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放和中性粒细胞的迁移，并在较低浓度下抑制酵母细胞与角质形成细胞的黏附率[49]。
5检测技术
真菌生物学纯化培养是光滑念珠菌检测的金标准，但其检测速度慢、时间久，近年来一些基于磁共振等能快速检测血液中念珠菌菌种的技术已发展起来，多重串联PCR全血、血清、血浆早期检测白念珠菌病的比较发现，在血清和血浆中检测到念珠菌DNA的频率比在全血中更高，但这些方法仍有一些敏感性和特异性问题[50-51]。研究发现，与巢式PCR、反向PCR相比，SYBRGreen实时荧光定量PCR技术可在1h内完成真菌检测过程，光滑念珠菌最低检出浓度为10拷贝/μL，并与其他念珠菌属病原无交叉反应，特异性较高[52]，采用基因芯片技术也可准确快速地检测出致病性念珠菌，比PCR检测结果更可靠。石星亮等[53]利用免疫层析技术，采用双抗夹心法制作成检测白色念珠菌的检测卡，可检测的最低浓度为104CFU/mL，检测速度快，准确率高。尽管现在市面上有利用乳胶凝集试验检测血清中菌体蛋白标志物的方式来判别念珠菌感染情况的商品化检测试剂盒，但其灵敏度很低，且在检测过程中菌体蛋白标志物易与相关的抗体形成免疫复合物，从而影响检测结果准确度。随着科技的进步，针对转录间隔区域(TIS)的寡核苷酸阵列系统、DNA微阵列芯片、Luminex技术、临床试验系统、蛋白质组、碳源检测、有限数量生长试验、荧光探针、基质辅助激光解析鉴定及电离飞行时间质谱等测定方法逐渐成熟，如在临床中应用最普遍的API20CAUX试纸条及商用光循环Septi-Fast系统等检测技术。
6展望
念珠菌病是一种人畜共患病，感染病原种类多样，症状相似难以区别，不同物种中致病性特征不同，在禽类中主要引起消化道疾病，而在感染人的过程中不仅引起皮肤性真菌病，也极易引起阴道感染，且念珠菌毒力因子差异明显，抗真菌药物敏感性不同，尤其是光滑念珠菌，表现出与其他念珠菌属真菌不同的毒力特性及药物敏感性。因此，在临床中辨别真菌感染种类至关重要。尽管现阶段对光滑念珠菌已有了一些了解，但关于其致病性毒力因子及过程、耐药性不断增强的机制及其感染动物治疗模型仍有待进一步探究。——论文作者：张双，郭禹，薛文慧，赵千惠，霍书英*
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