摘要：探讨不饱和脂肪酸对人脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)的形态、增殖、免疫表型及分化潜能的影响。采用0.15%Ⅷ型胶原酶消化法从皮下脂肪组织中分离获得ADSCs，使用添加了油酸或亚麻酸的培养基对ADSCs进行传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态，计数法绘制细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞表面抗原，同时使用特定的诱导培养基对细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导培养和染色鉴定，并采用实时定量PCR检测三系分化诱导培养9d后成脂、成骨及成软骨相关标志基因mRNA的表达水平。结果显示，0.15%Ⅷ型胶原酶消化法能获得形态均一的ADSCs;培养相同的时间后，与未添加脂肪酸的空白对照组相比，含有20μmol/L油酸或亚麻酸的培养体系中所收获ADSCs的细胞数量增加了20%左右;各组细胞CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈阳性表达，CD31、CD45呈阴性表达;使用20μmol/L油酸或亚麻酸进行传代培养的细胞经成脂、成骨、成软骨诱导后，油红O、茜素红、阿利新蓝染色呈阳性反应，同时细胞中的成脂标志基因PPAR-γ、成软骨标志基因SOX9和COL2A1及成骨标志基因ALP、OCN、RUNX2的mRNA表达水平较对照组显著增加。实验结果表明油酸及亚麻酸能够促进ADSCs增殖，维持细胞的免疫表型且提高细胞的三系分化潜能。
关键词：脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs);不饱和脂肪酸;油酸;亚麻酸;生物学特性
人脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是存在于脂肪组织中的一种多潜能干细胞，在特定条件下可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多种细胞[1]。ADSCs免疫原性低，可减少同种异体间移植的排斥，且具有旁分泌功能，可分泌多种生长因子及炎性因子[2]，在修复、替换、维持或增强组织和器官功能等研究领域显示出强大的再生医学功能，因此被广泛应用于临床研究[3]。据《中国医药生物技术协会》网站提供的信息(http://www.cmba.org.cn/common/index.aspx-nodeid=281&pagesize=1&pagenum=10.htm)，截至2020年11月，在国家卫生健康委员会备案的干细胞临床研究机构增至111家，备案项目达100个，其中有5个临床研究项目使用的细胞为ADSCs，包括广东省中医院开展的ADSCs治疗中重度寻常型银屑病的试验;上海交通大学医学院附属仁济医院开展的异体ADSCs治疗膝骨关节炎的临床研究;聊城市人民医院开展的ADSCs治疗中重度溃疡性结肠炎及肺动脉高压的临床研究等。国内外多项ADSCs相关动物及临床研究证实，ADSCs具有应用于糖尿病足[4]、心肌缺血[5]、脑损伤[6]等修复治疗的潜力。
脂肪酸是生物体的供能物质和生物膜的重要组成部分，是膳食中重要的能量来源物质。脂肪酸根据饱和程度的不同可分为饱和脂肪酸(saturatedfattyacid,SFA)和不饱和脂肪酸(unsaturatedfattyacid,UFA)，其中不饱和脂肪酸又分为单不饱和脂肪酸(monounsaturatedfattyacid,MUFA)及多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)[7]。不饱和脂肪酸及其代谢产物是细胞结构和功能的重要组成部分，因此在干细胞命运调控方面具备特定的功能。2014年Kang等[8]在StemCells上发表的综述中提到，Ω-6和Ω-3族PUFA及其代谢产物与细胞结构及功能有关，它们可以通过多种作用机制，影响不同来源间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的生物学特性，例如促进多种干细胞的增殖及分化，继而影响干细胞的命运调控。目前，关于PUFA在干细胞分化中的作用研究主要集中在PUFA来源的代谢产物，包括花生四烯酸(arachidonicacid,AA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)、前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、白三烯B4(leukotrieneB4,LTB4)、血栓素A2(thromboxaneA2,TXA2)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoicacid,DPA)，而研究的细胞模型多以神经干细胞为主，对MSCs的研究较少[8-9]。只有少量研究涉及DHA、EPA和AA等对人脐带、骨髓来源MSCs增殖或分化方面的影响[10-11]。三系分化能力是鉴定MSCs的标准之一，已有研究表明脂肪酸能影响体外培养的成肌干细胞的分化[12]，但目前尚未有研究报道脂肪酸对ADSCs三系分化能力的影响。本研究旨在体外分离、培养ADSCs，并应用不饱和脂肪酸作用于ADSCs，探究MUFA中的油酸和PUFA中的亚麻酸对ADSCs形态、增殖、免疫表型及分化潜能的影响，以期为ADSCs提供更优化的培养体系以及为脂肪酸应用于MSCs方面提供研究基础。
1材料与方法
1.1材料脂肪组织取自东莞市第五人民医院的志愿者，使用含2%青链霉素混合液的生理盐水保存。
杜氏磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco'sphosphate-bufferedsaline,DPBS)、磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline,PBS)、α-MEM(MEMalphabasic)培养基、0.125%胰酶(Gibco公司，美国);人血小板裂解液(Helios公司，美国);Ⅷ型胶原酶(Sigma公司，美国);油酸[>85.0%(SG)]、亚麻酸[>70.0%(SG)](梯希爱化成工业发展有限公司);MSC成脂诱导分化试剂盒、MSC成骨诱导分化试剂盒、MSC软骨诱导分化试剂盒、阿利新蓝、油红O、茜素红(赛业生物科技有限公司);青链霉素混合液、4%多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司);流式单抗PEmouseIgG1κisotypecontrol(PE-ISO，同型对照)、PEmouseanti-humanCD13、PEmouseanti-humanCD29、PEmouseanti-humanCD44、PEmouseanti-humanCD73、PEmouseanti-humanCD90、PEmouseanti-humanCD105、PEmouseanti-humanCD31、PEmouseanti-humanCD45(BD公司，美国);TriQuickReagent(北京索莱宝科技有限公司);QIAzolLysisReagent(QIAGEN公司，德国);逆转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒(TaKaRa公司，日本);ultrapuredistilledwater(Invitrogen公司，美国);BIOG血清血浆游离RNA提取试剂盒(常州百代生物科技股份有限公司)。
1.2ADSCs的分离、培养与传代
取志愿者皮下脂肪组织，使用含2%青链霉素混合液的生理盐水与脂肪组织充分混匀，400g离心7min后倒出脂肪组织，重复数次上述洗涤步骤，直至无明显血液残留。按照1∶1体积比加入0.15%Ⅷ型胶原酶溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中消化30min，期间每隔5min混匀一次。消化完成后400g离心7min，弃上层脂肪，细胞沉淀重悬于含1%青链霉素混合液和5%人血小板裂解液的α-MEM培养基中。将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤后接种于T-175培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养72h后更换不含青链霉素混合液的培养基并除去未贴壁细胞，之后每隔3d换液，细胞融合度达80%后用0.125%胰酶消化2~3min，加入3倍体积的生理盐水稀释消化，以1∶3比例传代，取第3~5代的细胞进行诱导增殖。
1.3油酸或亚麻酸诱导ADSCs增殖的最佳浓度筛选
油酸、亚麻酸分别使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培养基稀释成20μmol/L、40μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L的浓度梯度。将P5代ADSCs以每孔5×104个细胞的密度接种于6孔板，细胞过夜贴壁后将培养基换成2mL含不同浓度脂肪酸的培养基，以不加脂肪酸的培养基为空白对照组，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养48h，吸弃旧培养液并用生理盐水清洗，随后用0.125%胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液。使用CounstarIM1200自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)检测细胞数量及细胞活率。
相关期刊推荐：《生命科学研究》主要反映世界各国生命科学领域中的最新研究成果，所刊登的论文90%来源于中国国家自然科学基金、国家科技部重大项目基金以及省级科学基金。本刊主要刊登国内外生命科学领域中的具有创造性的学术论文及少量反映国内外重大进展或热点问题的快讯或综述性文章，覆盖的主要学科是：生物化学与分子生物学、发育生物学、细胞生物学、生物技术、遗传学、植物学、动物学、微生物学、解剖学、生理学、基因工程、农业工程、病理学、毒理学、药理学、免疫学、基础医学等等。
为优选最佳的使用浓度，首先设置大范围的浓度梯度，得出合适的浓度范围，再设置小范围的浓度梯度来测定具体的数值。因此，将油酸、亚麻酸使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培养基继续稀释成10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L的浓度梯度。将P4代ADSCs以每孔2×104个细胞的密度接种于6孔板，细胞过夜贴壁后将培养基换成2mL含不同浓度脂肪酸的培养基，以不加脂肪酸的培养基为空白对照组，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养72h，吸弃旧培养液并用生理盐水清洗，随后用0.125%胰酶消化细胞，终止消化后制备单细胞悬液并进行计数，比较各组的细胞数量及细胞活率。
1.4油酸或亚麻酸对ADSCs形态的影响及生长曲线绘制
取5×104个ADSCs(P3代)接种于10cm的培养皿中，细胞过夜贴壁后将培养基换成10mL含20μmol/L油酸或亚麻酸的完全培养基(含5%人血小板裂解液的α-MEM培养基)，以不加脂肪酸为空白对照组，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔24h在各组中随机选择3个培养皿，吸弃旧培养液并用生理盐水清洗1次，吸弃生理盐水后再加1mL的0.125%胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹打混匀，取20μL细胞悬液与20μL0.2%台盼蓝溶液混匀后加样到细胞计数板上，使用细胞计数仪检测细胞数量及细胞活率(每孔取3个视野计数后取平均值进行统计分析)，以时间为横轴，总细胞个数为纵轴绘制细胞生长曲线。各组细胞培养48h后，在显微镜下观察并记录其形态是否有差异。
1.5流式细胞术检测细胞免疫表型
取P3代细胞以4500cm-2的密度接种于T-175培养瓶，细胞过夜贴壁后将培养基换成含20μmol/L油酸或亚麻酸的完全培养基继续培养，以不加脂肪酸为空白对照组，细胞融合度达90%后，取各组细胞进行流式细胞术分析。流式细胞术检测的具体步骤如下：收集各组ADSCs并使用1mLPBS重悬细胞后计数，将1mL细胞悬液均分至11个EP管中，每个EP管中的细胞数量为2.2×105个，3000r/min离心6min，小心弃上清后再加入25μL的PBS重悬细胞沉淀，将流式单抗PE-ISO(同型对照)及CD13、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105对应的抗体各取5μL加入相应的EP管中，阴性对照组加入5μL的DPBS(未染色的细胞即为阴性对照)，混匀后4℃冰箱避光孵育30min。孵育终止后，每管加入500μL的PBS洗涤样品，3000r/min离心6min，小心弃上清。洗涤两次后加入200μL的PBS重悬，将细胞悬液转移到流式管中，采用流式细胞术分析细胞表面抗原的表达情况。
1.6细胞三系分化能力检测
取P3代的ADSCs细胞以4500cm-2的密度接种于T-175培养瓶，细胞过夜贴壁后将培养基换成含20μmol/L油酸或亚麻酸的完全培养基继续培养，以不加脂肪酸为空白对照组，细胞融合度达90%后，取各组细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导培养并染色鉴定。
成脂分化能力检测：取4.5×105个ADSCs接种到装有2mLMSC培养基的6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到90%时，换成2mLMSC成脂分化培养基A液[含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛];3d后更换为2mL培养基B液(含胰岛素及10%FBS);24h后再更换成A液诱导，循环诱导7d后使用油红O染液进行染色鉴定。
成骨分化能力检测：取4.5×105个ADSCs接种到装有1mLMSC培养基的12孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞长到基本融合时，更换1mLMSC成骨分化培养基，每隔2d更换一次MSC成骨分化培养基，培养14d后使用茜素红进行染色鉴定。
成软骨分化能力检测：收集各组细胞并制备成单细胞悬液，计数后取出含有1.0×106个ADSCs的细胞悬液，1200r/min离心获得细胞沉淀，吸弃上清后加入10μLMSC培养基重悬细胞沉淀，取5μL细胞沉淀置于24孔板，以形成细胞微团。将细胞置于培养箱中培养，2h后向24孔板中加入1mLMSC成软骨诱导分化培养基，每隔2d换一次MSC成软骨诱导分化培养基，培养14d后使用阿利新蓝染液进行染色鉴定。
1.7Q-PCR检测成骨、成软骨及成脂分化相关标志基因的表达水平
取P3代细胞以4500cm-2的密度接种于T-175培养瓶，细胞过夜贴壁后将培养基换成含20μmol/L油酸或亚麻酸的培养基继续培养。细胞融合度达90%后，取1×106个细胞接种到装有2mL完全培养基的6孔板中，每组重复2个孔，培养24h后更换特定的诱导培养基进行成脂、成骨、成软骨诱导培养。诱导9d后根据QIAZolLysisReagent说明书分别提取各组ADSCs的总RNA，并用微量分光光度仪检测RNA的浓度和纯度，随后根据逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。以cDNA作为模板，以GAPDH为内参，采用Q-PCR检测成脂标志基因PPAR-γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ)、成软骨标志基因SOX9(SRY-relatedprotein9)和COl2A1(typeIIcollagen-A1)以及成骨标志基因ALP(alkalinephosphatase)、OCN(osteocalcin)、RUNX2(runt-relatedtranscriptionfactor2)的mRNA表达水平。上下游引物均是根据NCBI提供的mRNA序列，使用Primer3Plus软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司最终合成。PCR引物序列见表1。——论文作者：李锦灵，林立龙，李治寰
