【摘要】目的探讨临床应用组织工程软骨行鼻再造术的安全性及效果。方法2014年3月—2015年10月，收治5例拟行全鼻再造患者。其中，1例4岁患儿为先天性鼻畸形者;其余4例成年患者为外伤所致鼻部亚单位缺损，男3例，女1例;年龄24～33岁，平均28.5岁。以鼻中隔软骨(儿童)或耳软骨(成人)来源的种子细胞来源与聚羟基乙酸(poly-glycolicacid，PGA)-聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)支架复合培养，在体外构建组织工程软骨。1例患儿一期行鼻部畸形矫正术、硅胶假体植入术，二期取出假体同时植入组织工程软骨;其余4例成年患者均采用额部皮瓣扩张法行鼻再造。鼻再造术后患者行1～4次鼻修整术;术中对植入的组织工程软骨进行观察，其中2例取材行组织学观察。结果术后3例患者出现低热;额部扩张皮瓣均成活，切口均Ⅰ期愈合，无感染、明显排斥反应、组织工程软骨外露等并发症发生。额部供区切口均Ⅰ期愈合。患者均获随访，随访时间9～74个月，平均54.8个月。随访期间患者鼻部无明显不适，通气功能良好，对鼻部外形基本满意。组织工程软骨组织学观察示术后早期1例出现明显钙化，另1例有软骨存在;术后远期1例呈纤维结缔组织表现，另1例仍有软骨存留。结论临床应用初步证明使用组织工程软骨行鼻再造安全，但其有效性仍需进一步验证。
【关键词】组织工程软骨;鼻再造;鼻缺损;鼻畸形
鼻位于面部中央，外鼻缺损或畸形对人的外貌有着显著影响。鼻再造是修复鼻缺损或矫正鼻畸形的主要方法，外被、支架和衬里是鼻再造的3个重要组成部分[1]。支架是整个再造鼻的骨架核心，是将二维皮瓣转化为三维立体结构的关键。本课题组前期采用3D打印技术在体外成功构建具有精细结构的组织工程鼻翼软骨[2]。为进一步探索该组织工程软骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014年3月—2015年10月我们将其用于治疗5例鼻缺损或畸形患者。现回顾5例患者治疗过程，总结临床观察结果，为今后研究提供参考。
1临床资料
1.1一般资料
本组1例4岁患儿为先天性鼻畸形。其余4例成年患者为外伤所致鼻部亚单位缺损，男3例、女1例;年龄24～33岁，平均28.5岁。既往均未对鼻畸形或缺损进行修复。临床资料详见表1。
1.2组织工程软骨构建
1.2.1种子细胞培养 局麻下，成年患者取耳甲腔软骨约0.12mL，儿童取鼻中隔软骨约0.013mL，置于0～4℃培养液中，即刻转送至实验室。使用酶消化法获得原代人耳软骨细胞/鼻中隔软骨细胞，用含H-DMEM培养基(GIBCO公司，美国)、5.0ng/mLbFGF(R&D公司，美国)、10%FBS(HyClone公司，美国)的完全培养基制成细胞悬液，以1.5×104个/cm2密度接种后，置于37℃、5%CO2及100%饱和湿度的培养箱内培养。待细胞生长汇合至70%～80%进行传代，收集第2代软骨细胞，备用。
1.2.2组织工程软骨构建 ①应用3D打印技术制备与正常鼻翼、鼻背形态相似的塑料支架，利用塑料支架制备石膏阳模与阴模。
②采用聚羟基乙酸(poly-glycolicacid，PGA)-聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)复合材料构建组织工程软骨支架。其中，PGA分子量约30000，由上海组织工程国家工程中心提供;PLA分子量约10000，购于美国Sigma-Aldrich公司。将无纺的絮状PGA纤维均匀铺在石膏阳模上，反复滴加含0.5%PLA的二氯甲烷溶液，至PLA干重占支架材料总质量的15%;待二氯甲烷大部分挥发后，扣上阴模加压使其成型。
③当制备的PGA-PLA材料达所需强度时，取出并修剪周围多余材料，获得相应形态的支架。将支架材料置于75%乙醇浸泡1h、紫外线照射30min消毒，无血清DMSM培养液洗涤5次，加入常规细胞培养液预培养48h，确定无污染后吸干培养液备用。
④取1.2.1制备的第2代软骨细胞，调整细胞浓度至1×106个/mL后接种于PGA-PLA支架材料上;采用软骨重分化培养液，于37℃、5%CO2及100%饱和湿度条件下培养12周，体外构建组织工程软骨。培养结束后，将其行HE染色检测，确定无感染后植入人体内。其中，早期收治的例1、2组织工程软骨制备为片状，为进一步缩短术中支架雕刻时间，例3、4、5将再造鼻背部分的组织工程软骨形状改为与隆鼻用硅胶L型支架一致。
1.3手术方法
本组1例先天性鼻畸形患儿一期行鼻部畸形矫正术、硅胶假体植入术，二期取出假体同时植入组织工程软骨;其余4例成年患者均采用额部皮瓣扩张法进行鼻再造。
1.3.1一期手术 一期行额部扩张器植入。全麻下，标记发际内切口线及扩张器置入范围。切开皮肤，在皮下层进行剥离，在帽状腱膜下层分离至预定范围。4例成年患者均置入300mL椭圆形扩张器，留置引流管1根，适当加压包扎。本组例4同时行鼻孔开大术。
术后14d切口愈合后拆线。拆线后1周开始向扩张器内注水，每周注水2次，每次注水15～20mL，待总注水量达600～750mL后停止注水并静置1个月。注水及静置共耗时5～6个月，平均5.75个月。
1.3.2二期手术
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受区切开松解瘢痕，依据局部瘢痕及黏膜情况制作衬里皮瓣，于鼻背正中皮下彻底松解组织，并于骨膜上方剥离形成腔隙。然后取出扩张器，设计额部带蒂皮瓣。局麻后，切开皮瓣按照蒂部扭转方位向下旋转皮瓣至受区。将构建的组织工程软骨适当修剪，分别置于鼻翼及鼻背，并与周围组织固定。将皮瓣与制备的衬里皮瓣缝合，缝合额部供区。
术后放置引流管，密切观察皮瓣血运及引流情况，2d后拔出引流管，14d后拆线。术后1个月开始使用肠钳夹持再造鼻蒂部血运进行锻炼，待血运阻断可达2h以上时，行三期皮瓣断蒂术。
1.3.3三期手术
三期行皮瓣断蒂术。全麻后，患者取平卧位，采用局部浸润麻醉后切断鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并将多余的蒂部组织剖开形成皮瓣，与额部受区分层缝合。断蒂后6个月左右水肿消退、皮瓣收缩和瘢痕稳定后[3]，根据患者鼻部外形行再造鼻修整术，包括修薄皮瓣形成鼻部精细结构、调整软骨支架、修复切口瘢痕等。本组5例患者行1～4次鼻修整术，平均2.2次。
1.4组织学观察本组
2例患者鼻修整术中取组织工程软骨进行组织学观察，其中例3分别于术后1年半、5年取材，例4分别于术后4年、5年进行取材。上述标本均行HE染色、EvG弹性纤维染色以及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。为方便表述，以术后早期(植入时间<2年)和远期(植入时间>2年)来区分。
2结果
2.1临床观察结果
4例成年患者二期术后72h内皮瓣远端均未出现静脉淤血现象，皮瓣均全部成活，切口Ⅰ期愈合，无急性期感染、明显排斥反应等并发症发生。额部供区切口均Ⅰ期愈合。4例成年患者中，2例患者(例3、例4)术后出现一过性低热，未予特殊处理，自行缓解;2例患者(例1、例2)鼻部肿胀程度较其余2例明显，经常规口服消肿药物处理后，切口均按时拆线。另1例患儿(例5)二期组织工程软骨植入术后出现持续性低热，鼻部肿胀明显，术后2d拔出引流管后引流管口延迟愈合，渗出液较多，取分泌物细菌培养阴性;6d时体温突然升高，考虑为扁桃体炎，对症予抗生素治疗后体温恢复正常，切口按时拆线。
术后5例患者均获随访，随访时间9～74个月，平均54.8个月。随访期间患者鼻部无明显不适，无组织工程软骨感染、移位或变形等并发症发生，鼻部形态明显改善，皮瓣色泽与正常皮肤相似，质地柔软，鼻部无明显通气障碍。患者对鼻部外形基本满意。见图1、2。
2.2组织学检测结果
镜下观察：术后早期(例3)取材HE染色可见散在的软骨组织结构，EvG弹性纤维染色阳性，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为弱阳性。其余大部分与纤维结缔组织表现相同，可见散在的无结构组织，旁边可见多核巨噬细胞浸润，考虑为PGA-PLA残余支架成分。术后远期取材中，例3患者HE染色呈纤维结缔组织特点，未见明显软骨组织结构，EvG弹性纤维染色呈阴性，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阴性，同样可见散在的无结构组织。例4患者取材中，1个标本呈明显骨化表现，另1个标本中可见明显软骨组织结构，HE染色、EvG弹性纤维染色以及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果则与例3术后早期结果相似。见图3。
3讨论
理想化的鼻部组织工程软骨是能在减少患者损伤的同时，提供更好的支架材料，降低手术难度，减少手术时间和鼻修整次数。Fulco等[4]首次在癌症术后患者中使用片状组织工程软骨进行单侧鼻翼重建，获得了较好的鼻翼功能与外形重建。除此之外，其他用于鼻部的组织工程软骨人体体内研究非常有限[5]。
在我们临床试验中，经过5年的术后随访，已初步证实了自体耳软骨细胞或鼻中隔软骨细胞复合PGA-PLA支架体外构建的组织工程软骨在鼻再造中的安全性。在3D打印技术辅助下，可以近乎精确地获得鼻翼和鼻背形状的组织工程软骨，但是随访发现植入后仍存在一些问题。组织学检测显示，组织工程软骨在植入鼻部后，软骨组织逐渐被吸收，取而代之的是纤维结缔组织，有少量的PGA-PLA支架材料残留。例4患者组织工程软骨植入体内8个月后就出现了明显的钙化现象[6]，但具体原因尚不知晓。在本课题组同期进行的组织工程软骨耳廓再造临床试验中，结果显示软骨支架移植入体内最早2个月就开始出现变形、坍塌，解剖结构模糊，MRI也显示植入的软骨被吸收[7-8]。尽管植入的组织工程软骨外形和力学性能尚可满足临床需求，但植入体内后出现的这种吸收、纤维化及钙化趋势，必然会导致不可预测的刚度变化及原位变形，并最终对头面部再造器官的外形产生影响。已有研究证实软骨微环境及种子细胞来源均对再生软骨类型有一定调控作用[9]，肋软骨来源种子细胞构建的组织工程软骨会表现出肋软骨的骨化倾向[10]。但是，目前对于维持组织工程软骨机变性的特异性生化成分尚不清楚，细胞生化、免疫学以及生物力学间的复杂关系也需进一步研究。
例5患儿在组织工程软骨植入后出现低热、鼻部肿胀、渗出液增多等情况，但分泌物细菌培养为阴性，因组织工程软骨的种子细胞为自体来源，所以考虑无菌性炎症可能是由支架材料的体内代谢或其他相关因素引起的。本试验中采用PGA和PLA作为支架材料，其在降解过程中产生的低pH环境会影响软骨细胞的生长、增殖和表型的维持，甚至导致细胞坏死[11]。在软骨构建过程，只有细胞材料复合物体外培养阶段，PGA-PLA支架未能充分降解，且该材料在人体内降解速度极为缓慢，即使在术后5年，构建的组织工程软骨中仍存在散在的支架材料未被降解。
与传统的肋软骨鼻再造法相比，采用组织工程软骨行鼻再造降低了受区损伤，同时因为避免了繁琐的肋软骨支架搭建，大大缩短手术时间，根据目前患者随访情况，远期手术效果与肋软骨支架鼻再造法无明显差异。但组织工程软骨构建较繁琐、价格昂贵，其在鼻再造中的应用仍处于探索阶段，距临床推广应用仍有一定差距。
要实现组织工程软骨在头面部器官重建中的大规模临床应用，需要解决更多问题。例如，如何解决组织工程软骨纤维化及骨化、如何将可能引发的免疫反应和炎症控制在最小。针对以上问题，我们依据组织工程三要素总结了可能的解决措施。①种子细胞。除成体软骨细胞外，BMSCs和脂肪MSCs也具有成软骨能力，它们是目前种子细胞的研究热点。有必要对MSCs分化调控及远期转归进行研究，以避免可能存在的风险[5]。②支架材料。为避免上述支架材料植入体内后的不良反应可不使用支架，采用细胞膜片技术[12]进行组织工程软骨的培养;或不植入支架，即加快支架材料在体外培养阶段的代谢速率;或者探索其他新的支架材料。通过不同方式提高天然材料的可塑性及力学强度，或将天然材料和人工合成材料进行复合，从而获得组织相容性较好、形态可控、力学性能合适的复合材料[13]，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物/脱细胞软骨细胞外基质支架材料、壳聚糖/丝素蛋白/纳米羟基磷灰石多层支架复合体[14]等，但这些支架材料在人体内的长期安全性及用于头面部器官重建的有效性尚不明确。③培养条件。动态培养环境比静态培养环境能更好地模拟人体内状态，动态生物反应器因而也更适宜组织工程软骨组织的生长。不同的种子细胞来源及所构建的软骨用途不同，所适宜的最佳动态软骨培养条件也存在差异[15]。本课题组自主研发了一种组合式组织工程动态培养仪[16]，但构建鼻部组织工程软骨的具体条件仍在进一步探索。
综上述，尽管已经初步证实了组织工程软骨行鼻再造术的安全性，但其有效性仍需进一步验证。为确保组织工程软骨在长期植入体内后仍能有足够的软骨存留，提高体外构建软骨的质量及功能是后续研究的重要方向。——论文作者：任朋洁，徐奕昊，范飞，田乐，陆晓娜，尤建军，王欢，郑若冰
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