摘要：实验室条件下可培养的微生物约占自然界中微生物总数的1%，这限制了人们对99%未知微生物的认识和利用，而研究表明，那些“不可培养的微生物”是可以被开发和利用的，未能被纯培养的微生物才是未知微生物的主体。微生物培养组学探索利用多种培养条件和长时间的培养，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖体RNA(rRNA)测序可以大规模鉴定各种微生物，同时利用全基因组测序和宏基因组测序手段对未知微生物进行深入分析。本文综述了国内外近年来微生物菌群培养组学在反刍动物胃肠道、禽类盲肠及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新进展，探讨将动物体内菌群培养组学方法应用于动物疾病防治领域的可行性。作为一个新兴的研究方法，尽管该培养组学还存在一些不够成熟的方面，但它的发展前景十分广阔，微生物菌群培养组学方法和其他研究方法的互补已经逐渐成为发展兽医微生物学新的突破口。
关键词：培养组学;MALDI-TOF-MS;16SrRNA;基因组测序;瘤胃微生物区系;盲肠微生物群;鼻腔微生物区系
动物体内和体表定植有大量微生物，这些共生微生物彼此之间、微生物与宿主之间通过相互的合作与竞争，形成了动态的、稳定的微生态平衡。在传统研究中，人们主要是在纯培养技术基础上对微生物进行研究，然而自然环境中微生物种类复杂，纯培养技术条件下可培养的种类仅占其1%，这极大地限制了人们在微生物多样性研究中的进展[1]。相关研究表明那些未培养微生物是可以被开发和利用的，未被纯培养的微生物才是微生物群体中的绝大多数[2]。近年来，传统意义上的微生物学和现代信息技术形成交叉，使得人们可以从新的维度对微生物的特性与功能进行研究，其中，与动物样本相关的肠道菌群基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)测序的通量和准确性的大幅提高，使得宏基因组测序等技术得以广泛应用[2]。尽管这种基于DNA信息分析解读的方法能帮助我们了解特定状态的微生物组成，但仍然限制了以获取活培养物为基础的微生物制药等相关行业的发展。因此微生物培养组学等基于活培养物分离、鉴定和开发的技术显得尤为重要[4]。
近年来，培养组学的发展使得可培养的人体细菌库剧增，人们对宿主-细菌之间相互作用关系的认知进一步加深。培养组学在动物医学中的应用使可培养的细菌大量增加，在临床致病菌分离鉴定中发现了新的分类群，且减少了在宏基因组学研究中的尚未明确分配的操作分类单元(operationaltaxo-nomicunits，OTUs)。本篇综述在介绍培养组学研究方法的同时，重点介绍培养组学新技术在动物医学领域的应用现状，并展望其未来的发展趋势。
1微生物菌群培养组学的发展与研究方法
培养技术是传统微生物学研究的重要方法，但由于技术和条件的限制，绝大多数微生物无法在体外进行人工培养，难以分离到新的菌株，作为补充，宏基因组学在鉴定新微生物的过程中发挥了巨大作用。宏基因组学最早是由Handlesman提出的，是指特定环境下全部微生物基因组的总和。宏基因组学以环境样本中的总DNA作为研究对象，通过构建宏基因组文库，加以克隆、异源表达等步骤来筛选有用基因及其产物，继而分析在复杂环境中的微生物多样性及种群结构、代谢活动等，可用于鉴定新的生物活性物质、筛选医药、开发新型酶[1]。但是宏基因组学也存在许多局限，首先由于测序读长较短，物种间的鉴别难度较大，使得菌种的精确分类变得困难;其次在宏基因组学分析中，分析工具亟待进一步优化以缩短工作时间，并应尽量减少存在于不同实验室之间分类分配方面的异质性;此外，宏基因组学因其“深度偏差”(depthbiases)缺陷，对低密度菌群(≤105CFU·mL-1)并不敏感，难以体现低密度菌群的分类学特征[5]。相关研究表明，肠道菌群种类多样性远超于宏基因组学预测范围[6]，且宏基因组学受多种变量干扰，不同的培养方式、DNA提取方法、信息分析软件差异都会对测序结果产生影响[7];宏基因组学测序得到的DNA片段里也有相当一部分难以识别和归类(即未分配OTUs)。综合以上原因，基于传统培养方法，结合高通量快速鉴定方法的培养组学(culturomics)逐渐建立。培养组学是一种利用多种条件对微生物进行纯培养的方法，其通过模拟微生物生长的自然条件使微生物区系在体外得以重建，再利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖体RNA(rRNA)测序对体外重建的细菌进行鉴定[8-9]。Lagier等[6]使用培养技术来证明使用培养组学在研究肠道微生物区系方面的效果不亚于焦磷酸测序。Angelakis等[10]通过一系列研究，认为通过结合宏基因组学与培养组学方法，可以比较完整地分类未知物种。事实上，初步研究发现，这两种方法的检测重复率为15%，以宏基因组学和培养组学方法研究属和种水平上的微生物区系都能观察到明显的互补性[10]。关于宏基因组学和培养组学的优缺点比较见表1。
培养组学首先需要对样本进行多重条件的培养，目的在于抑制多数有生长优势的微生物，并促进低浓度微生物的生长，再利用适当的条件对特定的分类群进行培养，其显著优势是使用基于细菌表面蛋白分子量检测的MALDI-TOF-MS技术对微生物进行高通量快速鉴定。如果质谱法未能鉴定成功，则需对样本进行细菌核糖体(16SrRNA)基因序列分析，即分析比较细菌rRNA序列的相关性以确定细菌种系的发生关系，若测序结果与最新的参考菌株相似匹配度低于98.65%，该样本分离株可能是一个新物种[11]。将得到的疑似新物种进行全基因组测序，最后，用分类基因组学描述或命名新分离的细菌，将从MALDI-TOF质谱和基因组测序得到的数据以统一格式上传至相应数据库，包括GenBank16SrRNA登录号和菌株数等信息，以便于快速共享培养组学发现的新物种信息。培养组学的工作流程如图1所示。
相关期刊推荐：《畜牧兽医学报》本学报是中国畜牧兽医学会主办，创刊于1956年7月，刊登较高水平的学术论文和企业研究报告以及对生产实践具指导性、启发性的文章。主要栏目包括畜牧和兽医两大学科。
由于有不同的生长特性，一些对营养要求比较高的微生物只有在含稀有元素、特定的营养配比和适当的培养环境中才能被成功培养。培养组学首要的是提供多种培养条件，以筛选动物体内挑剔细菌的最佳生长条件。以专性厌氧菌为例，为满足其生长条件，需要提供特定的设备和专门的试剂，包括含有多种补充剂(碳源、大量元素、金属和一些生长因子)的复杂培养基。此外，为能在缺氧条件下培养细菌，已经设计出大量厌氧系统如厌氧罐、厌氧室和加斯帕系统等[12]。最后是选择和鉴定由于低阈值浓度(少于105CFU·mL-1)而没有被焦磷酸测序检测到的少数细菌群体。通过向培养基中添加抗生素[13]和其他抑制剂[14]、主动或被动过滤细菌[15]、对粪便样本进行热休克[16]、加入噬菌体[17]等方法可以抑制培养基中生长旺盛的菌种。还可以通过使用血培养瓶[11]，添加粪便提取物[18]，添加抗坏血酸[11]、瘤胃液[19]、脂质[20]等来富集生长贫瘠的菌种。
2培养组学在反刍动物瘤胃微生物研究中的应用
反刍动物出生之际，其消化道中不含细菌等微生物。随着不断与外界环境接触，其机体内微生物区系得以建立，且瘤胃环境内的微生物种类和数量最多，其中细菌占据主导地位，除此之外还有原虫、厌氧真菌等[21]。反刍动物的消化主要依赖于瘤胃环境中的微生物群，其对反刍动物的生产性能具有重要的影响作用[22]。有研究表明，瘤胃内容物的细菌总密度为1010～1011CFU·g-1，其中纤毛虫含量为104～106个·g-1，真菌密度为102～104CFU·g-1[22-23]。瘤胃微生物的组成结构、特定微生物组的质量和数量可以影响动物的能量吸收效率[24]，生产上可以通过改变日粮组分以改变瘤胃微生物组成来影响宿主动物，从而影响其生理功能[25]。微生物培养组学的诞生，极大地推进了反刍动物瘤胃微生物的研究进展，大量未知的瘤胃微生物可以通过已确定和未确定的厌氧培养基(含瘤胃液)进行培养，相关的基于微生物区系体外重建和高通量测序的研究也促进了反刍动物瘤胃微生物培养组学的发展。
2.1瘤胃微生物纯培养技术
Hungate滚管技术以及手套厌氧培养箱已广泛应用于厌氧微生物的分离培养[23]。由于不同的微生物对生长环境和特殊偏好营养物的需求各异，研究者可据此设计不同的培养方案对其进行筛选、分离、鉴定、纯培养。培养和筛选过程中，可以通过调整生长环境参数(如培养基酸碱度、营养因子等)抑制杂菌生长，从而减少杂菌对目标微生物增殖的影响。主要的操作方法为在厌氧室内取部分瘤胃内容物样品，厌氧环境：50mL·L-1H2、200mL·L-1CO2、750mL·L-1N2。采用0.22μm滤膜过滤后的1×厌氧磷酸盐缓冲液，以10倍稀释法将样品从原液稀释至10-6浓度。每块培养基分别接种100μL不同浓度的样品混合液，在厌氧室内39℃培养3d。作为空白对照，每种培养基类型取2个培养基，不进行接种，与其他培养基一起孵育。此外，取适量用于稀释瘤胃样品的缓冲液，接种至培养基作参照。上述培养结束后，取1mL无菌无氧的8.5g·L-1NaCl溶液均匀刮洗平板，用吸管收集该平板上所有的微生物，以备后续鉴定[26]。以现有的微生物培养方法为基础，不断地改进培养设备，综合并优化各项培养条件/方式，可以更好地对目标微生物进行体外纯培养。
2.2细菌鉴定技术研究
16SrRNA扩增和测序技术为描述新的细菌种类和分离培养细菌提供了便利，提高了细菌鉴定的效率[27]。rDNA分子测序分析技术是微生物群种属研究上应用较成熟的方法。由于16SrRNA基因由9个高变区组成[10]，对细菌进行种属鉴定时常选择的鉴定区域为16SrDNA的V3、V4区[28]，在细菌的科、属、种鉴定以及进化分析中常用的核糖体数据库有Silva、Green-Gene和RibosomalDatabaseProject(RDP)等[29]。尽管原核生物16SrRNA基因序列分析技术广泛应用于细菌菌种的分类鉴定，但是其经济成本和时间成本较高，限制了该技术在培养组学中的应用。2009年，首次有报道称MAL-DI-TOF-MS作为一种新的病原微生物快速诊断方法，可满足临床上对微生物“属”和“种”的两级精确鉴定的需要[30]，该方法具有快速、工作程序简单、灵敏度高、分辨率高的优点，通过检索特征性质质谱峰数据库或与已知微生物的质谱峰比较可以实现对微生物的快速鉴定[31]。MALDI-TOF-MS在培养组学中的创新应用使广大研究者探索复杂的菌群环境成为可能。
2.3培养基类型、样品稀释度和系统发育与瘤胃微生物可培性的关系
目前，反刍动物瘤胃微生物培养组学中亟待解决的难题是有关影响培养因素的研究，以及如何增强未知微生物可培育性。2018年，Zehavi等[26]研究显示，多因素性状决定了瘤胃微生物的可培育性。培养基类型、样品稀释度均会影响瘤胃微生物在凝胶平板上的丰度，且后者的影响作用更甚。另外，瘤胃环境中OTUs丰度与可培养性呈正相关。瘤胃的复杂性和功能谱系超出了当前人们预期，但是其中一部分稀有的微生物中可以在纯培养中进行研究，这使人们得以更深入地了解瘤胃生态系统及其功能。
反刍动物瘤胃微生物群的培养是瘤胃微生物培养组学研究的重要内容之一。随着瘤胃微生态系统研究技术的进一步发展，反刍动物消化系统微生物功能得以深入研究。计算机科学与自然生命科学的交叉融合，使得组学技术在诠释瘤胃微生物的组成功能及代谢特征中作用凸显，尤其是在瘤胃微生物资源研究中，培养组学的重要性不言而喻。在瘤胃微生物培养组学研究中找出该系统生境中可被培养的部分以及各种影响其可培性的因素十分重要。采集样品的稀释度与实验过程中使用的各种类型的培养基都会影响瘤胃微生物的可培性，说明在体外重建瘤胃微生物系统仍需要大量细致的培养条件试验和探索。研究人员通过培养组学发现瘤胃微生物的复杂性及其功能谱系远超预期。因此，通过对瘤胃微生物区系进行体外重建，以深入了解其生态/生物功能，对开发应用瘤胃微生物资源具有重要意义。——论文作者：彭娜，彭先启，乐敏
