[摘要]目的：研究中药单体柚皮苷(NG)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化过程中MAPK信号通路的影响。方法：观察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制剂SB203580、PD98059、SP600125及3种抑制剂全部加入的情况下，各组碱性磷酸酶(AIJP)、骨钙素(BGP)、I型胶原(ColI)等骨向分化指标的差异。用Westernblotting技术检测各组p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平，用荧光定量PCR技术检测细胞因子转化生长因子B(TGF一13。)、骨形成蛋白2(BMP一2)和核心结合因子ctl(Cbfet1)mRNA的表达。结果：(1)10mol/L为本实验中NG的最佳促骨向分化浓度。(2)NG最佳浓度组的ALP和BGP含量比其它各组都高(P<0.05)，ColI含量无明显差异(P>0.05);与NG组相比，加入不同抑制剂组的AIjP、BGP和ColI表达量出现不同程度的降低。(3)与空白组相比，NG组JNK蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05)，p38蛋白的磷酸化水平降低(P<0.O1)，ERK1/2蛋白的磷酸化水平无明显差异(P>0.05)。与NG组相比，加入不同抑制剂组的p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平有升高也有降低。(4)NG组上调BMP一2的表达(P<0.05)，下调Cbfcd的表达(P<0.05)，而对TGF—B。的表达无明显影响(P>0.05)。与NG组相比，加入不同抑制剂组的TGF—p1、BMP一2和CbfctlmRNA表达量出现不同程度的降低。结论：NG主要通过激活MAPK信号通路中ERK通路、JNK通路以及上调BMP一2的表达，促进MSCs的骨向分化。NG上调BMP一2的表达受MAPK通路中p38通路的影响较大。
[关键词]柚皮苷;骨髓间充质干细胞;骨向分化;MAPK信号通路
骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是在骨髓中发现的一种起源于中胚层、具有自我复制能力和多向分化潜能的非造血干细胞。MSCs向成骨细胞(osteoblast，OB)分化的特性可为骨生长及骨修复提供细胞来源，在骨性疾病的治疗上拥有非常良好的应用前景。MSCs向OB分化是个复杂的过程，涉及多种信号通路的调控，其中与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinase，MAPK)信号转导途径关系密切。已有研究表明，MAPK通路中的细胞外信号调节激酶(extracellular—signalregulatedproteinkinase，ERK)、p38MAPK和c—Jun氨基末端激酶(C—JunN—terminalkinase，JNK)通路参与了OB分化增殖的信号转导，并在应激、凋亡及骨质代谢、炎症中发挥重要作用…。
柚皮苷(naringin，NG)作为中药骨碎补主要成分之一，大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其变种的果皮及果实中。NG具有促进OB增殖和分化、抗过敏、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血脂、抑癌等多种药理活性_2J。在促进MSCs骨向分化方面虽然已有文献进行了初步研究J，但其作用机制尚不清楚。本研究采用中药单体NG对SD大鼠MSCs进行干预，观察在NG促MSCs骨向分化过程中ERK、p38和JNK通路的作用及与骨转化调控因子之间的关系。
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材料和方法
1动物
清洁级(SPF)Spragne—Dawley(SD)大鼠，雌性，3月龄，体重200g左右，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2o06—0015。
2主要仪器和试剂
倒置相差显微镜(Olympus);CO2培养箱(Rev—CO);酶标仪(Bio—Rad);数码照相机(Gallon);扫描电子显微镜(Philips);PCR仪、稳压恒流电泳仪、IQ5RealTimePCRDetectionSystem(Bio—Rad)。
—MEM(HyClone);胎牛血清(Gibco);胰蛋白酶、TritonX一100(Amreseo);噻唑蓝(Mar)、DMSO、pNPP(Sigma);SB203580(SB，p38通路抑制剂)、PD98059(PD，ERK通路抑制剂)、SP600125(SP,JNK通路抑制剂)购自碧云天生物技术研究所;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所;大鼠骨钙素(boneglaprotein，BGP)EHSA检测试剂盒、大鼠胶原酶I(collagenaseI，ColI)ELISA检测试剂盒、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)测定试剂盒购自南京建成生物研究所;兔多克隆I抗(CellSignaling)，辣根过氧化物酶(ho~eradishperoxidase，HRP)标记的Ⅱ抗(CellSignaling)，Trizol(Invitro.gen);氯仿、异丙醇(广州化学试剂厂);Taq酶、反转录酶购自大连宝生物工程有限公司;引物由上海生工合成;柚皮苷购自中国药品生物制品检定所;其余试剂均为国产分析纯。
制备NG母液并设置不同浓度梯度一J。取l0mgNG溶于85LDMSO溶液中配制成0.2moUL母液。用仅一MEM完全培养基稀释母液，分别得到浓度为1×10一mot/L、1X10～mot/L、1×10mot/L、1X10～mol//L、1X10～moVL、1X10一mot/L和1X10mot/L的NG溶液。
3方法
3.1原代MSCs的分离提取与鉴定全骨髓贴壁法提取大鼠MSCs。3月龄SD雌性大鼠，颈椎脱臼法处死，置75%乙醇中浸泡10min。无菌条件下迅速分离出双侧股骨，剔净股骨上附着的脂肪结缔组织和骨膜，迅速移人超净台。将分离好的股骨放入75%乙醇中浸泡30S，随后用D—Hanks缓冲盐溶液冲洗4～5次，放人无菌培养皿内，剪去股骨两头的干骺端。用5mL注射器吸取含10%FBS的完全培养基反复冲洗骨髓腔数次，收集冲出液，用吸管充分吹打均匀，得到细胞悬液。用1mL注射器将细胞悬液按1×10cells/L的密度接种到25cm塑料培养瓶中，置37℃、5%CO、饱和湿度的培养箱中培养。24h半量换液1次，以后每3d全量换液1次。待贴壁细胞达到80%一90%融合后，传代培养。杂细胞随换液而被逐渐弃除，据差速贴壁原理，MSCs不断纯化。倒置显微镜下观察细胞形态特征，用流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD45，并用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞超微结构。
3.2细胞增殖活性测定取生长状态良好的P3代MSCs，0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，以2x10"cell/)密度接种于96孔板中，每孔中的体积分别为100L，24h待所有细胞贴壁后，吸出每孔培养液，换成无血清培养基，24h细胞周期同步化后开始添加不同浓度柚皮苷。吸净每孔培养液，取配制好的不同浓度的柚皮苷工作液，按设置的浓度加入不同组别，使各组的终浓度分别为1x10-3mo/L、1x10-molL.1x10-smol/L，1x10-6molL.1x10-7mol/L，1x10-"mol/L，1x10-mol/L，空白组中仅加入完全培养基，不加NG溶液作为对照。每个浓度设6个复孔，每孔终体积200L。各组添加不同浓度柚皮背后培养3d，进行MTT检测。弃去培养液，D-Hanks液冲洗3次，更换无血清的a-MEM培养基180L/well，同时加入5g/LMTT20LL/well，置37 ℃5%CO2培养箱中孵育4h后，小心弃去上清液，加人DMSO150uL/well，置微孔板振荡器上振荡10min，在酶标仪上测吸光度(A)值，测量波长为490nm，以未接种细胞的空白对照孔作为调零孔。
3.3以ALP活性确定NG最佳促骨向分化浓度采用pNPP法检测不同浓度NG对MSCs分化中ALP活性的影响。取P3代细胞，以5x10'cella/LI密度接种到6孔板中，每孔3mL。用含10%FBS的a-MEM培养基培养6d，更换无血清培养基培养24h24h细胞周期同步化后，更换为含有不同浓度NG的完全培养基。培养72h后，吸弃孔中的培养基，用D -Hanks洗2遍。每孔加入细胞裂解液(0.1%Tritonx-100)1mL，4℃作用20min。收集裂解液采用对硝基酚磷酸盐法测定ALP浓度。以pNPP为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37C、pH10.0条件下，每分钟转化产生1umol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位。用BCA法测定裂解液中总蛋白浓度，以蛋白含量(ug)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据标准曲线，算出样品实际浓度(g/L)，ALP活性以10U/gprotein表示。
3.4实验分组及各项指标检测确定NG最佳促MSCa骨向分化浓度后，以该浓度NG和通路抑制剂对MSCs进行干预[3-1]。实验分为6组：(1)空白对照组(control);(2)NG组;(3)NG+SB203580(NG+SB)组;(4)NG+PD98059(NG+PD)组;(5)NG+SP600125(NG+SP)组;(6)NG+3种抑制剂(NG+SB+PD+SP)。实验取P3代均质性良好的MSCs以1x10"cells/L的密度接种于24孔板，共6组，每组6个复孔。待细胞接种24h后，换入无血清培养基，24h细胞周期同步化后，再加人药物及完全培养基，每孔终体积1mL。培养板置于37℃，5%co2培养箱中继续培养：(1)空白对照组每3d正常换液1次;
(2)NG组加人最佳浓度的NG及完全培养基;(3)-(6)组在每次换液前，分别加人3umol/LSB2035804umol/LPD98059和5umol/L.SP600125预处理30min，然后加入最佳浓度的NG及完全培养基继续培养，加药后培养3d与其它各组同时取细胞上清液和细胞进行指标检测。
3.4.1ALP活性测定吸尽各孔培养液，用PBS洗3次，每孔加200uL0.1%TritonX-100，4℃冰上裂解，收集细胞裂解液，取30L加于测定管内，按照ALP试剂盒说明操作，标准管加入30uL酚标准应用液(0.02g/L)，空白管加入双蒸水30山L，各管均加入缓冲液50L和基质液50uL，充分混匀，37℃水浴15min，加入显色剂150L，立即混匀，选择520nm波长，酶标仪测定各管吸光度。根据说明书上相应公式计算ALP活性，用金氏单位(King'su-nit，每克组织蛋白在37℃与基质作用15min产生1mgt为1个金氏单位)表示。
3.4.2BCP分泌测定吸弃孔中的培养液，用PBS洗2遍，每孔加人细胞裂解液200山，冰上裂解20min，收集裂解液-20℃保存待测。标准曲线制备及样品测定按说明书操作，于酶标仪上450nm波长处测定A值，并通过标准曲线计算样品中BGP含量，用4e/gprotein表示。
3.4.3Col1含量测定分别取各组的细胞培养上清液，标准曲线制备及样品测定按说明书操作，于酶标仪上490nm波长处测定A值，并通过标准曲线计算样品中Col1含量，结果用mg/gprotein表示。
3.4.4Westernbloting检測磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK和磷酸化p38的表达吸弃培养基，用PBS洗2遍，再加入细胞裂解液4℃裂解30min，12000/min离心10min取上清液，用BCA法测蛋白浓度。配制12%分离胶和5%积层胶进行SDS-PAGE电泳，每孔上样量501go以GAPDH作为内参照。电泳结束后转膜，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭，分别加入免抗p38抗体、ERK抗体、JNK抗体、GAPDH抗体、p-p38抗体、p-ERK抗体和P-JNK抗体于4℃孵育过夜。洗膜，加入HRP标记的相应的羊抗兔1gG抗体于室温孵育1h。洗膜，ECI.显影曝光，得到胶片，比较各条带的灰度值，分析所检测蛋白的磷酸化水平。
3.4.5荧光定量PCR技术检测TGF-B，、BMP-2和CblalmRNA的表达总RNA的提取采用Trizol法进行，紫外分光光度计检测浓度，并用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。将其逆转录为cDNA以18SrRNA为内参照
