[摘 要]目的：测定隐球菌性脑膜炎患者中干扰素-γ(IFN-γ)和转化生长因子-β(TGF-β)表达并分析其临床意义。方法：在本院2016年1月至2018年10月确诊为隐球菌性脑膜炎患者中选取63例纳入观察组，并选取同期60名健康体检者，纳入正常对照组。测定两组受试者入组时外周血CD4+T细胞中辅助T细胞(Th细胞)相关细胞因子表达水平，包括IFN-γ、TGF-β及白细胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-9、IL-17，并对比观察组治疗前后上述指标变化，分析各指标间相关性。结果：观察组治疗后TGF-β、IL-6、IL-17表达水平均较治疗前升高，其治疗前后IFN-γ表达水平均高于正常对照组，TGF-β表达水平均低于正常对照组;观察组治疗前IL-9、IL-17表达水平低于正常对照组，其治疗后IL-6高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组63例患者中，共有42例于治疗3周后完全应答或部分应答，应答率为66.67%。剔除未应答患者后对比有应答组与正常对照组Th相关细胞因子表达水平，结果显示，有应答组治疗前IFN-γ表达水平高于正常对照组，IL-17表达水平低于正常对照组，其治疗后IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-9、IL-17表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析示，观察组TGF-β表达水平与IL-9、IL-17均呈正相关，r值分别为0.829、0.781，其IL-6、IL-17表达水平亦呈正相关，r值为0.880(P<0.05)。结论：隐球菌感染初期TGF-β抑制可能是导致患者病情加剧的主要原因，而TGF-β诱导Th17细胞分化及促进IL-17分泌功能对于控制患者病情进展有积极作用。
[关键词] 隐球菌性脑膜炎;干扰素-γ;转化生长因子-β;细胞因子
隐球菌性脑膜炎属中枢神经系统隐球菌感染性疾病，具有起病隐匿、病程长等特点，致残、致死率均处于较高水平[1]。该病好发于免疫功能低下人群，如人免疫缺陷病毒(HIV)感染者、器官移植者等，故多数研究均认为机体免疫功能在抵御隐球菌感染中发挥了重要的作用[2]。T淋巴细胞相关免疫状态与机体免疫功能具有密切关联，辅助T细胞(Th细胞)在机体体液免疫、细胞免疫功能调节中均发挥着重要作用，其中，Th1细胞主要产生干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)等，被证实能够抑制隐球菌的生长与扩散[3];Th17细胞分泌的IL-17及与Th17分化相关的转化生长因子-β(TGF-β)，也可能在隐球菌感染时发挥重要的调控作用[4]。此次研究就隐球菌性脑膜炎患者外周血IFN-γ和TGF-β表达特点进行了分析，旨在了解Th1、Th17细胞在隐球菌性脑膜炎发病机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
自我院2016年1月至2018年10月确诊为隐球菌性脑膜炎患者中选取63例，纳入观察组。纳入标准：患者无化疗和放疗史，未合并自身免疫性疾病，HIV感染检测结果呈阴性，无器官移植。63例患者中，男40例，女23例，年龄21~67岁，平均(40.25±11.73)岁，病程7~42d，平均(41.59±6.97)d。按照年龄相近、性别相仿原则，选取同期体格检查、实验室检查及影像学检查均未见异常的健康体检者60名，纳入正常对照组，其中男38名，女22名，年龄25~63岁，平均(38.87±12.05)岁。此次研究已获取我院医学伦理委员会批准，受试者均知情同意并签署书面协议。
1.2 检测方法
抽取两组受试者入组次日晨起空腹外周静脉血10mL，以20U/mL肝素抗凝，行外周血单个核细胞分离，而后采用磁珠分选细胞分离CD4+T细胞[5]：
(1)使用PBS洗涤细胞悬液，以300g离心10min，弃上清;
(2)每107个细胞加入缓冲液80μL、磁珠分选细胞(MACS)CD420μL，吹打混匀;
(3)4℃避光孵育15min;
(4)加入缓冲液3mL，洗涤细胞;
(5)于4℃环境下以300g离心10min，弃上清，加入缓冲液500μL，悬浮细胞;
(6)将MS分离柱置于MidiMACS分选器内，加入缓冲液500μL，湿柱;
(7)将细胞悬液缓慢加入分选柱，自然析出非CD4+T细胞悬液;
(8)使用500μL缓冲液冲洗MS分离柱3次;
(9)将MS分离柱移出磁场，加入缓冲液1mL，冲出滞留在MS分离柱中的CD4+T细胞;
(10)使用PBS洗涤细胞悬液，以300g离心10min，弃上清，细胞沉淀保存于-70℃环境中。
参照文献方法[6-7]抽提标本总RNA，逆转录合成cDNA，使用实时定量PCR法，测定两组受试者CD4+T细胞中IFN-γ、TGF-β及IL-4、IL-6、IL-9、IL-17表达水平。
1.3 分析方法
对比观察组、正常对照组入组时外周血CD4+T细胞中Th相关细胞因子表达水平差异，并于观察组患者治疗3周后再次抽取其外周血，测定CD4+T细胞中IFN-γ、TGF-β及IL-4、IL-6、IL-9、IL-17表达水平并与治疗前检测结果进行对比。此外，根据治疗效果，分析剔除治疗无效病例后观察组患者上述指标变化情况，治疗效果判断标准参照文献[8]，完全应答：临床症状消失，脑脊液墨汁染色涂片计数正常，脑脊液隐球菌培养转阴，脑脊液乳胶凝集滴度明显下降，生化正常;部分应答：临床症状好转，脑脊液常规及生化改善，真菌培养阴性。无应答为出现以下情况之一：临床症状或脑脊液常规、生化恶化或真菌培养阳性。将完全应答和部分应答患者归为好转组与正常对照组进行比较。分析Th相关细胞因子的之间的相关性。
1.4 统计学分析
对本临床研究的所有数据采用SPSS18.0进行分析，IFN-γ、TGF-β表达水平等计量资料以(x±s)表示，并采用t检验，相关性分析采用Pearson法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1Th相关细胞因子检测结果
观察组治疗后TGF-β、IL-6、IL-17表达水平均较治疗前升高，其治疗前后IFN-γ表达水平均高于正常对照组，TGF-β表达水平均低于正常对照组;观察组治疗前IL-9、IL-17表达水平低于正常对照组，其治疗后IL-6高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
观察组63例患者中，共有42例于治疗3周后完全应答或部分应答，应答率为66.67%。剔除未应答患者后对比观察组与正常对照组Th相关细胞因子表达水平，结果显示，观察组治疗前IFN-γ表达水平高于正常对照组，IL-17表达水平低于正常对照组，其治疗后IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-9、IL-17表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.2 相关性分析
Pearson相关性分析示，观察组TGF-β表达水平与IL-9、IL-17均呈正相关，r值分别为0.829、0.781，其IL-6、IL-17表达水平亦呈正相关，r值为0.880(P<0.05)。
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3 讨论
机体对隐球菌细胞介导的免疫反应以直接细胞毒作用和细胞因子介导的调节作用为主，自然杀伤细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞均可直接产生细胞毒作用，但同时也受到细胞因子的调节[9]。Th1细胞主要分泌IFN-γ，同时也可分泌IL-2、IL-18和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，Th2则主要分泌IL-4。多数学者认为，Th1、Th2表达水平处于相对平衡状态，是机体抵御病原菌感染的重要基础[10-11]。
动物研究显示，在隐球菌感染模型中，IFN-γ可通过活化巨噬细胞、刺激巨噬细胞分泌抗菌蛋白、增加两性霉素B抗菌活性等机制，发挥保护性免疫效应[12]。亦有研究指出，将重组IL-12、IL-18用于播散性隐球菌感染小鼠的治疗，能够有效促进隐球菌在肺部的清除，改善小鼠生存周期[13]。然而，本研究结果示，无论是否剔除未好转患者，观察组治疗前后IFN-γ表达水平均高于正常对照组，且患者治疗前后IFN-γ表达水平未见明显变化，说明在隐球菌性脑膜炎患者中，IFN-γ的保护作用并不占主导作用，其原因可能为：机体感染隐球菌后，IFN-γ在急性期或慢性期抗隐球菌效应中均可发挥积极作用，但仅有IFN-γ的存在，并不能有效抵御隐球菌感染[14]。
与IFN-γ相比，TGF-β在隐球菌性脑膜炎发生发展中扮演的作用更为重要：一方面，TGF-β在激活后，能够促进机体抵抗隐球菌效应的上升;另一方面，TGF-β是幼稚T细胞向Th17细胞分化的必需条件，其积极应答状态也是机体抵御隐球菌感染的关键环节[15-16]。此外，在IL-6缺乏的前提下，TGF-β可能诱导幼稚T细胞向调节性T细胞分化，与多种自身免疫性疾病的发生发展亦具有一定关联[17]。在本次研究中，观察组治疗后TGF-β表达水平较治疗前升高，且剔除未好转患者后，观察组治疗后TGF-β表达水平高于正常对照组，与此同时，TGF-β与IL-17表达水平呈正相关，提示TGF-β诱导IL-17表达上升，可能是促进机体抵御隐球菌感染的重要机制。伴随着TGF-β表达水平的上升，患者IL-9表达水平亦呈上升趋势，IL-9也参与了抵抗隐球菌感染的免疫机制。除此之外，隐球菌性脑膜炎患者IL-6、IL-17表达水平亦呈正相关，据此推测，在IL-6存在的条件下，TGF-β可阻断或破坏Th1、Th2细胞分化，而产生主要分泌IL-17的Th17细胞[18]，再一次印证了上述结论。
综上所述，隐球菌性脑膜炎患者外周血CD4+T细胞中IFN-γ表达与机体抵御隐球菌感染能力有关，但并不占主导作用，而TGF-β表达水平的上升伴随着IL-9、IL-17的增加，对于增强机体对隐球菌杀伤作用、改善患者病情有着重要意义，值得进一步关注。
